Pax5基因在野生型斑马鱼全胚胎发育早期的表达

目的为了深入了解在胚胎发育过程中,尤其是在早期B淋巴细胞的生成和中脑的发育过程中pax5基因可能的作用及其机制,选择斑马鱼作为实验动物,构建野生型斑马鱼pCS2+-pax5重组质粒,并观察pax5基因在野生型斑马鱼胚胎中的表达。方法提取斑马鱼胚胎总RNA后经RT-PCR克隆斑马鱼pax5基因片段,将得到的pax5基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后,在T4DNA连接酶的作用下插入pCS2+质粒中,通过对重组质粒进行双酶切、菌落PCR以及插入片段序列测定鉴定后,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的pax5基因的反义mRNA探针。将得到的探针用全胚胎原位杂交技术检测pax5基因在斑马鱼早期发育过程中的表达。结果成功构建pCS2+-pax5重组质粒并制备了pax5基因的反义mRNA探针,通过斑马鱼原位杂交技术,发现在斑马鱼受精后18～72小时(18～72hpf)胚胎头部的小脑、中脑后脑交界处均可观察到pax5基因阳性杂交信号;在24～72hpf胚胎的耳蜗均可观察到pax5基因的阳性杂交信号,且随着时相的增长其表达逐渐增多;在18～48hpf胚胎的脊索部位可见pax5基因的阳性杂交信号。结论明确了pax5基因在斑马鱼胚胎的脑部、脊索神经系统高表达,并首次证实其在耳蜗听神经的早期发育过程中有表达,可能对斑马鱼早期胚胎神经系统的发育起着某些至关重要的作用。

转录因子PAX5对多发性骨髓瘤细胞IM9的抗凋亡及促增生作用

目的:应用DNA介导的RNA干扰技术使核转录因子PAX5基因沉默,观察PAX5对下游基因调节以及细胞增殖和抗凋亡的影响。方法:筛选高表达PAX5的肿瘤细胞株。构建针对PAX5的siRNA表达载体并转染入多发性骨髓瘤细胞IM9,筛选稳转细胞系。RT-PCR分析PAX5敲低细胞中p53、XBP-1和c-Myc等重要基因表达水平的影响,同时用MTT和流式分析分别检测细胞增殖和细胞凋亡率。结果:PAX5在多发性骨髓瘤细胞株IM9中特异性表达,而KAS6和前列腺癌细胞DU145和PC3中没有表达。利用RNA干扰技术敲低IM9细胞中PAX5,不仅可使p53、XBP-1的表达增加,同时观察到c-Myc的表达下降。MTT实验证实PAX5基因沉默的IM9细胞增殖速率明显低于对照组细胞,同时对5-FU的药物敏感性增加。结论:PAX5在多发性骨髓瘤细胞株IM9中特异性的表达,并可促进肿瘤的生长和抗药性。本研究中进一步发现,PAX5除可调节p53和XBP-1基因的表达,c-Myc的表达也随PAX5敲低而下降,提示PAX5有可能直接参与c-Myc的转录调节并在肿瘤发生中起到作用。

全外显子组测序技术对两个眼前节发育不良家系致病基因检测

目的筛查两个眼前节发育不良(anterior segment dysgenesis,ASD)家系的致病基因突变。方法对2个来自河北和河南的ASD家系进行分析。在获得受检者同意后,对家系成员进行详细的眼科检查,采集外周静脉血,提取全基因组DNA。依据测序需求选取家系1中2例患者及1名正常对照、家系2中1例患者及1名正常对照进行全外显子组测序,对测序结果筛选候选基因,运用Sanger测序进行验证。利用Poly Phen-2,SIFT Human Splicing Finder软件进行突变危害性预测。结果家系1连续3代均有患者发病,符合常染色体显性遗传特征,9例患者有均不同程度的双眼ASD。得到13个SNV和55个In Del候选突变,在候选基因PAX6中,家系1发现一已知错义突变c.T2A(p.M1K);家系2中共8名成员,其中2例患者,在测序中发现一已知剪切位点突变c.357+1g>c。3个预测软件作出危害性预测。结论外显子测序技术快速检测出PAX6基因中T2A(p.M1K)和c.357+1g>c突变,并确定其为ASD的致病突变。

血浆PAX5、SEPT9和WIF-1基因启动子甲基化在原发性胃癌中的诊断价值

目的通过测定胃癌患者血浆中细胞内游离DNA中PAX5、SEPT9和WIF-1基因启动子的甲基化情况,分析它们与胃癌疾病特征间的联系,并探讨三种基因启动子甲基化在筛查原发性胃癌中的协同检测功能。方法利用巢氏甲基化特异性PCR技术(MDA-nMSP)检测2020年12月至2021年12月收治的81例胃癌患者(胃癌组)血液样本中的PAX5、SEPT9和WIF-1基因启动子的甲基化率。另选取同期年龄构成相似的39名健康者作为对照组,比较两组各基因甲基化率的差异,并通过受试者工作特征(ROC)曲线评估血浆甲基化PAX5、SEPT9和WIF-1对胃癌的预测价值。结果胃癌组血浆PAX5、SEPT9及WIF-1甲基化率分别为38.3%、34.6%、46.9%,高于对照组的7.7%、10.3%、5.1%,差异均有统计学意义(χ2=12.123、7.956、20.683,均P<0.01)。PAX5和WIF-1基因启动子甲基化的发生与患者年龄相关(P<0.05),SEPT9基因启动子甲基化的发生与肿瘤大小相关(P<0.05)。作为诊断靶点,甲基化PAX5诊断胃癌的敏感度为38.27%,特异度为92.31%,曲线下面积(AUC)为0.653;SEPT9分别为34.57%、89.74%、0.622,WIF-1分别为46.91%、94.87%、0.709,三者联合诊断胃癌的敏感度、特异度分别为61.73%(95%CI:50.3%~72.3%)、84.62%(95%CI:69.5%~94.1%),AUC为0.732(95%CI:0.653~0.810)。结论原发性胃癌患者血浆PAX5、SEPT9和WIF-1基因启动子甲基化率较高,三种甲基化基因联合诊断胃癌的特异度与单一基因诊断相似,但敏感度有较大提升,有望成为新的胃癌检测基因组合。

胃癌患者血浆PAX5和RNF180基因甲基化情况及其临床意义

目的观察胃癌患者血浆配对盒蛋白5(paired box protein 5,PAX5)与环指蛋白180(ring finger protein 180,RNF180)基因甲基化情况,探讨其与临床病理特征及预后的关系。方法110例胃癌患者为胃癌组,同期体检健康者50例为对照组,采用甲基化特异性PCR法检测血浆PAX5与RNF180基因甲基化状态,分析其与胃癌患者临床病理特征的关系。随访3年,采用Kaplan-Meier生存曲线分析PAX5、RNF180甲基化与患者预后的关系。结果胃癌患者血浆PAX5、RNF180基因启动子区甲基化发生率(70.00%、62.73%)高于对照组(32.00%、30.00%)(P<0.05),胃癌组TNM分期Ⅰ~Ⅱ期患者血浆PAX5、RNF180基因甲基化发生率(65.17%、57.30%)低于TNM分期Ⅲ~Ⅳ期患者(90.48%、85.71%)(P<0.05),胃癌组男性与女性、年龄<55岁与≥55岁、肿瘤直径<2.5 cm与≥2.5 cm、细胞低-中分化与高分化及有无淋巴结转移患者血浆PAX5、RNF180基因甲基化发生率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。发生PAX5基因甲基化的胃癌患者3年生存率(68.83%)低于未发生甲基化患者(84.85%)(P<0.05),发生RNF180基因甲基化的胃癌患者3年总体生存率(73.91%)与未发生甲基化胃癌患者(73.17%)比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论胃癌患者血浆PAX5与RNF180基因甲基化发生率增高,与肿瘤TNM分期有关,发生PAX5基因甲基化的患者3年总生存率低。

伴有9p异常的急性B淋巴细胞白血病患者PAX5基因重排及缺失的研究

目的探讨PAX5基因重排或缺失在伴有9p异常[abnormalities at chromosome 9p，abn（9p）]成人急性B淋巴细胞白血病（B—lineage acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）中的发生情况及临床意义。方法选取横跨PAX5基因的RP11-344823和RP11—652D9克隆，常规抽提DNA，采用缺口平移法标记荧光素，应用荧光原位杂交技术对50例伴有abn（9p）异常的BALL患者进行PAX5基因重排或缺失的筛选，并分析其临床及实验室特征。结果50例伴有abn（9p）异常的B-ALL患者中，PAX5完全缺失的患者有23例（46％），PAX5部分缺失的患者有2例（4％），PAX5基因易位1例（2%），总的异常率为52％（26／50）。PAX5重排或缺失组患者与PAX5正常组患者的主要临床特征的差异无统计学意义。结论abn（9p）的B-ALL患者中PAX5缺失或重排的发生率为52％，PAX5异常患者（26例）与PAX5检测正常患者（24例）之间生物学特征无显著差异。