牛pAcGFP-FADD融合蛋白真核表达载体构建及在CHO-K1细胞中的表达

FADD是Fas/FasL系统的一个信号连接蛋白,通过传递凋亡信号,介导细胞凋亡。为了揭示FADD在牛卵泡发育过程中的调控作用,采用RT-PCR从牛卵巢组织中扩增FADD基因,将其cDNA终止密码子删除,采用定向克隆技术连接到带有水母绿色荧光蛋白(AcGFP)报告基因的真核表达载体pAcGFP-Nl中,构建融合蛋白重组质粒,经BglⅡ/EcoRⅠ酶切、测序鉴定后,用脂质体介导质粒转染CHO-K1细胞,观察有无荧光的表达及用RT-PCR和Western blotting方法检测基因转录、表达情况。结果表明,成功克隆牛FADD基因,通过PCR方法在FADD阅读框两端引入了BglⅡ和EcoRⅠ克隆位点,并于起始位点前加入Kozak序列,成功构建pAcGFP-bFADD融合蛋白真核表达载体,重组质粒转染CHO-K1 24 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,转染效率可达65%,通过RT-PCR扩增出654 bp的转录产物,并用Western blotting检测到51.4 kD目的蛋白的表达。

pAcGFP1-N1-FOXQ1真核表达载体的构建及在大肠癌细胞系Colo-320中的表达

目的:构建人FOXQ1(homo sapiens forkhead box Q1)基因真核表达载体pAcGFP1-N1-FOXQ1,并在大肠癌细胞系Colo-320中瞬时表达.方法:利用PCR方法从YR Gene装载了FOXQ1基因全长cDNA序列(NM_033260)的质粒中扩增出FOXQ1的cDNA片段,与真核表达载体pAcGFP1-N1连接,重组质粒经PCR、双酶切和测序鉴定无误后,采用Lipofectamine 2000瞬时转染Colo-320细胞,应用荧光显微镜观察转染效率、Western blot检测FOXQ1蛋白表达水平.结果:成功构建了真核表达载体pAcGFP1-N1-FOXQ1,PCR、双酶切和测序鉴定结果均正确,载体能在Colo-320细胞中正确表达FOXQ1蛋白.结论:成功构建FOXQ1真核表达载体,为进一步开展体内、体外实验,研究FOXQ1基因在肿瘤发生发展中的功能奠定了实验基础.

稳定表达PAcGFP1-Golgi质粒的中国仓鼠卵巢细胞株的构建

目的:将质粒PAcGFP1-Golgi转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)并进行筛选纯化,得到单一克隆细胞株,从而构建能很好显示高尔基体形态、分布和功能的新模型。方法:将质粒PAcGFP1-Golgi以脂质体法转染CHO细胞,稳定后用G418筛选、平板稀释法克隆细胞;克隆完成后以激光共聚焦显微镜观察高尔基体形态及分布,动态监测荧光表达率,MTT法检测细胞增殖活性。结果:成功获得稳定表达质粒PAcGFP1-Golgi的CHO细胞株,激光共聚焦显微镜下高尔基体显示清晰,荧光表达率高达(99.31±0.26)%且表达稳定,细胞增殖活性与空白CHO细胞无异。结论:稳定表达PAcGFP1-Golgi质粒的CHO细胞株构建成功,为进一步研究高尔基体、COG复合体及其与遗传性糖基化障碍疾病之间的关系打下基础。

牛FADD基因的克隆分析及其真核表达载体的构建

【目的】克隆牛FADD基因并构建真核表达载体,以探讨其在牛卵泡发育过程中的调控作用。【方法】采用RT-PCR技术,从牛卵巢组织总RNA中反转录FADD cDNA,对编码区核苷酸序列分析后,将其全长cDNA删除终止密码子,采用定向克隆技术连接克隆到含有水母绿色荧光蛋白(AcGFP)报告基因的真核表达载体pAcGFP-Nl中,用BglⅡ、EcoRⅠ双酶切、测序进行鉴定,并进行了牛FADD mRNA的组织表达谱分析。【结果】克隆的牛FADD基因编码区全长序列与NCBI公布的序列完全一致,核苷酸和氨基酸序列与猪的同源性最高,与鸡的同源性最低,仅为42.5%和44%;通过PCR方法在FADD阅读框两端引入了BglⅡ和EcoRⅠ克隆位点,并于起始位点前加入Kozak序列,成功构建pAcGFP-N1-bFADD融合蛋白表达载体。组织表达谱分析表明,牛FADD mRNA高表达于肝脏、淋巴组织及睾丸、卵巢组织,在小肠、心、胰腺、肺、肾及肌肉中则弱表达或无表达。【结论】成功克隆了牛FADD基因,并构建pAcGFP-N1-bFADD融合蛋白表达载体,为FADD基因在牛卵母细胞发育调控中的基础研究提供了一种简便可靠的方法。

人脑微血管内皮细胞ACTG1基因真核表达载体的构建及表达

为了构建人脑微血管内皮细胞ACTG1基因的真核表达载体及在HEK293细胞中的表达,本研究采用RT-PCR方法,以单增李斯特菌侵染的人脑微血管内皮细胞提取的总RNA为模板,扩增ACTG1基因片段,TA克隆后经Sal I和Eco R I双酶切、测序等鉴定重组质粒,重组质粒再经双酶切,与真核表达载体p ACGFP连接,酶切鉴定后,Lipofactamine 2000转染HEK293细胞,荧光显微镜检测绿色荧光;同时采用Western-blotting对表达产物进行了鉴定。结果表明:PCR扩增得到1128 bp的ACTG1基因片段,ACTG1-p ACGFP真核表达载体构建成功,转染24 h后,在荧光显微镜下可见绿色荧光,Western-blotting检测分析,其分子量约为68 k Da的融合蛋白,与预期的大小相符合,表明重组蛋白表达成功,本研究为单增李斯特菌与脑微血管内皮细胞c DNA文库中相互作用蛋白的筛选和鉴定奠定了基础。

表达绿色荧光蛋白的伪狂犬基因缺失病毒的构建

通过酶切、补平、连接的方法对PUSK载体质粒进行改造,消除了该载体上的BamHⅠ和HindⅢ两酶切位点。根据pAcGFP1-C1基因序列设计1对引物,分别在上、下游引物的5′端引入了NotⅠ酶切位点,通过PCR扩增将目的基因AcGFP(包括GFP、CMV、MCS、SV40 Poly(A))克隆入经改造的PUSK载体内,构建了转移载体质粒PUSG。利用脂质体介导的方法,将转移载体质粒PUSG与伪狂犬病病毒基因组DNA共转染PK-15细胞。于荧光显微镜下48 h便能观察到绿色荧光,用吸管将有荧光的病变细胞吸出,经连续传代3次得到了纯化病毒。重组病毒的获得为下一步研制二价或多价疫苗的筛选提供了方便。

牛FADD基因过表达和RNAi载体构建及在牛胎儿成纤维细胞中的表达

FADD(Fas-associated death domain protein)存在于Fas/FasL系统中,是信号传导通路的一个信号连接蛋白,FADD通过传递凋亡信号,从而介导细胞凋亡。为进一步验证FADD基因抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用,从牛卵巢组织中扩增FADD基因,将FADD基因连接到带有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pAcGFP-N1中,构建过表达FADD基因载体,并构建FADD基因的RNAi载体;用脂质体介导法将FADD基因RNAi载体、真核表达载体转染到牛胎儿成纤维细胞中,观察有无荧光的表达,并使用Real-Time qPCR和Western blot方法检测FADD基因mRNA、蛋白水平的表达情况。结果表明:成功构建出FADD基因RNAi载体和高表达载体,重组质粒转染牛胎儿成纤维细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,转染效率可达50%。