A型流感病毒PB2蛋白帽子结合结构域的原核表达与鉴定

A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源重组策略将8×His标签与一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的CBD区基因序列克隆至原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-8×His-CBD,经PCR及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经不同浓度IPTG诱导不同时间后,经SDS-PAGE检测蛋白表达后使用镍柱纯化。结果显示,菌体裂解上清中在21 ku处可见目的条带,与8×His-CBD蛋白预期大小符合,且以0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导6 h时蛋白表达量最高,镍柱纯化后可获得纯度大于95%的8×His-CBD蛋白。为确定该蛋白是否具有生物学活性,本研究以帽子结构类似物m7GTP对其进行等温滴定量热试验,结果显示8×His-CBD蛋白和m~7GTP结合时存在明显热峰,表明8×His-CBD蛋白具有生物学活性;经计算,其Kd值为1.71×10^(-5)(±2.92×10^(-6))mol/L。本研究结果对流感病毒的基础研究和抗流感病毒药物的研发具有借鉴意义。

固定化耐酸曲霉对Pb2+的去除及机理研究

固定化微生物技术凭借处理效率高、投入成本低的优势在重金属废水处理领域应用颇为广泛,然而相关的重金属去除机理尚不明确。以从酸性矿山废水中筛出的耐酸曲霉Aspergillus sp.MF1作为研究对象,对其进行固定化处理,运用亚细胞分离技术以及五步提取法并通过SEM、FTIR表征初步揭示固定化Aspergillus sp.MF1去除Pb^(2+)的机理。研究结果表明,在pH为3.5,初始Pb^(2+)质量浓度为10 mg/L时,固定化Aspergillus sp.MF1对于Pb^(2+)的去除率最高可达78.26%。固定化Aspergillus sp.MF1去除Pb^(2+)的机理可归纳为两点,一是源于固定化Aspergillus sp.MF1载体的高比表面积、聚乙烯醇和海藻酸钠等材料表面活性基团对Pb^(2+)的吸附,二是归于Aspergillus sp.MF1细胞壁对于Pb^(2+)的螯合、吸附和离子交换作用,以及液泡和其他细胞器的隔室化作用。此外,固定化Aspergillus sp.MF1连续循环使用5次对Pb^(2+)的去除率均能达到30%以上,且在去除过程中未发生破裂、细胞泄露等情况。

生物炭吸附溶液中Pb2+的定性及定量研究

由木质纤维素类生物质经过热解制得的生物炭能够高效地吸附污水中的重金属离子,将其作为Pb^(2+)吸附剂,具有广阔的应用前景。本文以松木与大豆秸秆为原料,分别在400、600、800℃下制备了生物炭,考察了其理化特性与吸附性能之间的关系,并对各吸附机制的相对贡献进行了定性及定量分析。研究结果表明:大豆秸秆生物炭的吸附性能(最大吸附容量分别为209.35、180.62和226.64 mg·g^(-1))远优于松木生物炭的(4.62、12.02和23.47 mg·g^(-1))。6种生物炭对Pb^(2+)的吸附过程都符合Langmuir模型和拟二级动力学模型,以化学吸附为主,受物理微观结构的影响较小。阳离子交换在生物炭吸附Pb^(2+)过程中占据重要作用,其中Ca^(2+)的交换能力最强。Pb^(2+)在生物炭表面的矿物沉淀主要为水白铅矿和碳酸铅。矿物质沉淀(贡献占比21.9%~76.8%)和阳离子交换(18.1%~72.5%)是大豆秸秆炭和松木炭对Pb^(2+)的主要吸附机制,其次是π电子相互作用和官能团络合。

62Sn36Pb2Ag组装焊点长期贮存界面化合物生长动力学及寿命预测

Sn基合金焊接接头是电子产品不可或缺的关键部位,是实现电子元器件功能化的基础,电子整机失效往往由于焊点的损伤所导致,焊点的寿命预测对电子产品的可靠性研究具有重要意义.金属间化合物(IMC)厚度是衡量焊点质量的重要参数,以IMC层厚度为关键性能退化参数,以62Sn36Pb2Ag组装的小型方块平面封装(QFP)器件焊点为研究对象,采用扫描电子显微镜对在94、120和150℃三种温度贮存不同时间后的焊点微观形貌进行表征,测量了IMC层的厚度,基于阿伦尼乌斯方程建立了双侧界面金属间化合物生长动力学模型.并以其作为关键性能退化函数,通过对初始IMC厚度进行正态分布拟合获得失效密度函数,进而获得可靠度函数对焊点的长期贮存失效寿命进行了预测.研究结果有望对长期贮存焊点的寿命预测方式提供新的思路,为62Sn36Pb2Ag钎料的可靠应用提供试验和数据支撑.

智能微流控检测芯片的构建及其Pb2+检测性能

通过将具有Pb2+响应性的聚(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-苯并-18冠-6丙烯酰胺)智能微凝胶与H型微通道相结合,构建了一种能便捷、灵敏、可视化检测水溶液中Pb2+浓度的新型智能Pb2+检测微流控芯片。该微流控检测芯片主要由软光刻技术构建,并结合紫外光照聚合在H型微通道中原位构建智能微凝胶。基于该微凝胶的Pb2+响应性体积相变和H型微通道中的流体流动,该微流控检测芯片能将Pb2+浓度信号有效转换为易于检测读取的、可视化的H型微通道中指示液覆盖的指示柱数目的变化信号。通过光学显微镜便捷观察测量指示液覆盖的指示柱数目的变化,实现了对水溶液中痕量Pb2+浓度的超灵敏定量检测。该微流控检测芯片为水环境中的痕量Pb2+浓度的便捷、灵敏、可视化检测提供了新策略。

靶向PB2基因的特异性siRNA抑制禽流感病毒(AIV)复制

根据siRNA设计原则,设计并合成5对靶向禽流感病毒(AIV)PB2基因的siRNA(PB2374,PB2665,PB2936,PB21031和PB21233),将其转染MDCK细胞,分别于转染前和转染后感染H5N1禽流感病毒A/Goose/Guang dong1/96株;在转染后24h、48h和72h分别收集上清液;通过血凝试验(HA)和Real-time PCR检测siRNA抑制AIV增殖的效果。血凝试验结果表明:所设计的5对siRNA中,PB2374抑制AIV增殖的效率为68%～71%,PB2963抑制AIV增殖效率为78%～81%;Real-time PCR检测到PB2374转染组PB2基因的转录水平与对照组比较降低3～3.3倍,PB2963转染组PB2基因的转录水平降低3.9～4.2倍。无论siRNA是先于还是迟于AIV感染,这两对siRNA都能明显地抑制AIV的增殖;本研究结果为开发抗AIV治疗制剂和动物机体抗AIV研究奠定了基础。

广东人H_5N_1毒株PB2基因进化和特性

目的:通过对人禽流感H5N1毒株PB2基因序列的因H变异分析,揭示毒株PB2基因特征与进化.方法:检测广东地区人禽流感H5N1毒株PB2基因核苷酸序列,同时检索全球人禽流感H5N1毒株PB2基因序列,采用DNAStar5.0软件对检索的人禽流感H5N1毒株PB2基因核苷酸序列进行比对和分析;并结合流行病学资料对变异毒株进行进化速度分析.结果:1997/200648株毒株PB2基因核苷酸序列同源性分成两组,1997/1998毒株为第一组(G1),2003/2006毒株为第二组(G2).PB2基因错义置换导致101个氨基酸位点变异,占比例13.3%(101/759).PB2基因Ks值为39.4×10-6～63.4×10-6Nt/d,Ka值为3.36×10-6～5.11×10-6Nt/d;提示PB2基因进化主要受到自发突变影响.2003/2006毒株(包括毒株GD-01-06)仅保留一个糖基化位点(NPT301-303),丢失3个糖基化位点,可能影响蛋白致病性和抗原性.结论:目前PB2基因进化分成两组,主要受到除自发突变影响;PB2基因丢失3个糖基化位点可能影响蛋白致病性.人禽流感H5N1毒株PB2基因在自然界变异非常频繁,不断变异将影响H5N1毒株在人-人传播能力和引发大流行.

锆变质处理对铸造ZCuZn40Pb2合金铸态组织和性能的影响

研究了锆变质处理及其变质处理后不同的熔体保温时间对铸造ZCuZn40Pb2合金铸态组织和力学性能的影响。结果表明,铸造合金ZCuZn40Pb2加入一定量的Zr可以细化其铸造组织,使粗大的板条状α、β组织变成短小的片状,提高合金的力学性能。当Zr加入范围在0.02%-0.04%时变质细化效果较好。Zr变质处理后随熔体保温时间的延长,存在变质衰退的现象,组织粗大,力学性能降低,保温30 min以内浇注,变质细化效果较好。

Pb2+与牛血清白蛋白结合的研究

综述了Pb2＋与牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）结合的研究,由Scatchard图分析表明,BSA与Pb2＋相互作用有两类结合部位,通过非线性最小二乘法拟合Bjerrum方程,得到Pb2＋-BSA体系的逐级稳定常数值。通过Hill系数可以判断Pb2＋与BSA的结合产生的协同效应。

Ti变质对ZCuZn40Pb2组织和力学性能的影响

研究了Ti变质处理及其变质处理后不同的熔体保温时间对ZCuZn40Pb2铸态组织和力学性能的影响。结果表明,ZCuZn40Pb2加入一定量的Ti可以细化铅黄铜的铸造组织,使粗大的板条状α、β组织变成短小的片状,从而提高合金的力学性能。当Ti加入量在0.06%～0.10%时细化效果较好。Ti变质处理后随熔体保温时间的延长,存在变质衰退的现象,保温30min以内浇注,变质细化效果较好。

复合变质处理对ZCuZn40Pb2组织和力学性能的影响

研究了B、Ti、Zr复合变质处理及变质处理后不同的熔体保温时间对金属型铸造ZCuZn40Pb2铸态组织和力学性能的影响。结果表明,B、Ti、Zr复合变质处理能够细化金属型铸造ZCuZn40Pb2的铸态组织和提高力学性能,改善铸态α和β相组织的分布状态。当B、Ti、Zr复合加入量分别为0.001%、0.02%、0.01%时细化效果较好。B、Ti、Zr复合变质处理后随熔体保温时间的延长,组织粗化,出现变质衰退。保温时间在90min以内仍能保持较好的变质细化效果和力学性能。

机械球磨制备Fe0/ZSM-5复合材料及其对Pb2+的去除研究

利用机械球磨法将零价铁(Fe^0)颗粒负载到疏水性、高硅比的ZSM-5分子筛上,成功制备出Fe^0/ZSM-5复合材料,研究了此复合材料对水溶液中Pb^(2+)的去除性能。XRD结果表明,Fe^0/ZSM-5复合材料保持了ZSM-5分子筛的晶体结构,元素点映射表明零价铁颗粒均匀地负载在ZSM-5分子筛上。实验结果表明,在30℃,初始Pb^(2+)浓度为1~100mg·L^(-1),pH值为3.0,Fe^0/ZSM-5复合材料投加量为0.2 g·L^(-1),反应时间为60 min条件下,Pb^(2+)的最大去除率和最高吸附量分别为78.05%和102 mg·g^(-1)。研究发现在去除Pb^(2+)的过程中伴随着Fe^(2+)的释放以及pH值的升高,且反应过程中释放出Fe^(2+)会加速Fe^0表面的给电子过程,增加其表面活性位点,进而进一步提升对Pb^(2+)的还原去除。研究表明,反应过程符合一级反应动力学。

环氧氯丙烷改性橙皮对含Pb2+废水的吸附研究

为了将橙皮加以资源化利用,使用氢氧化钠和环氧氯丙烷对橙皮进行改性制备改性橙皮吸附剂,通过SEM分析了改性前后橙皮表面形貌,通过单因素试验考察了改性橙皮对废水中Pb^(2+)的吸附效果,并通过正交试验对吸附条件进行优化。SEM分析表明,改性后橙皮表面发生了显著变化。极差分析结果表明,在影响吸附效果的因素中,Pb^(2+)初始浓度对吸附效果影响最为显著,其次分别是溶液pH值、吸附剂投加量和环氧氯丙烷加入量。最佳吸附条件为:Pb^(2+)溶液初始浓度为350mg/L,pH值为6,吸附剂投加量为6g/L,环氧氯丙烷加入量为5ml,对Pb^(2+)的吸附量为25.13mg/g。该研究为橙皮的综合利用和含Pb^(2+)废水的处理研究提供了理论参考。

禽流感病毒新疆株A/Duck/XJ/4(H5N1)的PB1、PB2和PA基因测序及进化分析

通过RT-PCR技术对禽流感病毒新疆株A/Duck/X J/4（H5N1）的PB1、PB2和PA基因分别进行了扩增及克隆，测序结果表明该毒株的PB2、PB1和PA基因全长核苷酸序列分别为2341 bp、2282 bp和2187 bp。同源性分析表明A/Duck/X J/4（H5N1）株与禽源、野生鸟类和猪源的禽流感毒株均有很高的同源性（86.3%-99.6%）。与人源毒株相比，PB2和PA与A/HK/156/97（H5N1）株的同源性较低（86.3%-88.7%）;与A/V ietnam/CL01/2004（H5N1）株和A/hum an/Zhejiang/16/2006（H5N1）株的同源性较高（93.0%-98.8%）;PB1与人源毒株A/HK/156/97（H5N1）、A/V ietnam/CL01/2004（H5N1）、A/hum an/Zhejiang/16/2006（H5N1）同源性为91.1%-93.2%。

天然矿物对重金属Pb2+的吸附性能研究

利用天然矿物吸附重金属Pb^2+,研究吸附剂量、pH、反应时间对吸附效果的影响,对其吸附过程进行吸附等温线和吸附动力学拟合。结果表明,随着吸附剂量的不断提高,初始浓度为50mg/L与100mg/L的重金属Pb^2+的吸附去除率均不断提高,而其饱和吸附量逐渐下降,天然矿物对重金属Pb2+的最大饱和吸附量为87.67mg/g。酸性条件下天然矿物对重金属Pb^2+的吸附效果较低,而偏酸性环境吸附处理效果较好。天然矿物对Pb^2+的吸附去除率随反应时间的增加而不断增加。天然矿物对Pb^2+的吸附过程符合Freundlich吸附等温模型,且Pb^2+的吸附过程拟合结果更加符合准二级动力学模型。

氨基化二氧化硅的制备及其对Pb2+的吸附研究

以多晶硅副产物水解制备的二氧化硅为原料,KH-550为改性剂,在乙醇中合成了氨基化二氧化硅。通过XRD、SEM、FTIR、原子吸收光谱法等表征方法对材料的结构、形貌和吸附性能进行分析。结果显示:二氧化硅经KH-550改性后,得到了氨基化二氧化硅,材料的分散性变好,对Pb2+的吸附效果有显著提高。25℃恒温振荡20 min,氨基化二氧化硅对Pb2+的吸附率达99.8%,比改性前提高了38.1%。

PB2蛋白E627V突变可增强H7N9病毒对小鼠的致病力

【背景】低致病性H7N9病毒自2013年在我国首次出现以来,研究发现其对家禽均呈现低致病力,对哺乳动物模型小鼠也不表现任何的致病力。但是,2015年在湖南分离的1株低致病性H7N9病毒(简称HuN/S40726),却对哺乳动物小鼠表现为高致病力。分析、推测导致该病毒对哺乳动物致病力改变的原因可能在于该病毒PB2蛋白E627V的改变。【目的】为了揭示该病毒致病力的变化原因以及对哺乳动物致病性增强的机制,提供人类H7N9病毒感染、危害增强风险预警,展开该研究。【方法】选取2013年低致病性H7N9病毒代表株(简称SH/S1053)和上述湖南HuN/S40726病毒,开展了哺乳动物致病力对比试验以及可能导致病毒发生致病力变化的相关基因位点对比分析。然后以HuN/S40726病毒为模式毒株,利用反向遗传学技术,成功建立了病毒的反向遗传操作系统;利用基因点突变技术定点突变了HuN/S40726病毒PB2蛋白的627位氨基酸,救获了重组病毒r HuN/S40726、r HuN/S40726-PB2/627E和r HuN/S40726-PB2/627K。通过小鼠感染模型评估了以上3株重组突变病毒对哺乳动物的致病力,分析了PB2蛋白627位氨基酸的突变对小鼠致病力的差异。然后通过构建HuN/S40726病毒及其突变病毒的聚合酶复合表达质粒系统,以SH/S1053病毒为背景毒株构建聚合酶复合表达质粒系统作为对照,使用双荧光素酶法检测了PB2蛋白627位氨基酸的不同突变体在293T细胞中的聚合酶活性,进一步分析PB2蛋白627位氨基酸影响病毒毒力的内在机制。【结果】通过哺乳动物致病力对比试验以及可能导致病毒发生致病力变化的相关基因位点对比分析,推测导致HuN/S40726病毒对哺乳动物致病力改变的原因可能在于该病毒PB2蛋白E627V的改变。重组救获病毒和突变株对小鼠致病性试验结果显示,PB2蛋白E627V的改变显著的增强了HuN/S40726病毒对小鼠的致病力,使得病毒MLD50由≥6.5 log10EID50变化为3.5 log10EID50,病毒毒力增强了至少1 000倍以上。聚合酶活性试验结果表明,无论是在33℃还是37℃下,PB2蛋白E627V的改变,显著提高了HuN/S40726病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性,与病毒对小鼠的致病性增强呈正相关性。【结论】PB2蛋白627位氨基酸(V)决定了HuN/S40726病毒对小鼠的高致病力。PB2蛋白E627V的改变能够显著增强HuN/S40726病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性,是引起HuN/S40726病毒对哺乳动物致病力的重要因素。

古典H1N1亚型猪流感病毒PB2 K627E突变对病毒复制能力的影响

旨在探索古典H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011(H1N1)PB2K627E突变对病毒复制能力的影响。利用反向遗传操作技术和点突变技术成功获得古典H1N1亚型猪流感病毒的拯救株(627K)和突变株(627E)后,分别在MDCK细胞和小鼠体内对拯救株和突变株的复制能力进行比较。体外MDCK细胞试验结果显示,突变株与拯救株相比,细胞病变(CPE)减小、空斑形态减小、生长曲线差异极其显著,表明突变株在MDCK细胞上的复制能力减弱。小鼠攻毒试验结果表明,突变株对小鼠体重变化的影响不明显,在小鼠肺中的病毒滴度明显下降,引起病理损伤较轻。体外MDCK细胞及小鼠攻毒试验结果均表明,突变株与拯救株相比复制能力降低。该结果不仅证实了猪流感病毒PB2 627位氨基酸是一种重要的毒力分子标记,同时还为进一步阐明其致病机制提供了条件。

AIV PB2基因靶向性M1GS核酶的构建及其体外切割活性测定

目的针对禽流感病毒(AIV)复制酶PB2亚基的基因构建具有靶向切割作用的M1GS核酶,为新型抗AIV反义药物的开发奠定基础。方法基于大肠埃希菌的核糖核酸酶P(RNase P),根据AIV PB2基因的序列特征,设计一小段与之互补的引导序列GS,通过PCR技术将其共价连接至大肠埃希菌RNase P催化性亚基(M1 RNA)的3'末端,以构建靶向性M1GS核酶。通过体外切割试验测定M1GS核酶的活性。结果构建了M1GS-T_(436)、M1GS-C_(341)两种M1GS核酶。体外切割实验证实,核酶M1GS-T_(436)可对靶RNA片段产生特异性切割;核酶M1GS-C_(341)虽可切割靶RNA片段,但可能属于非特异性切割。结论成功构建并筛选出一种具有显著体外切割活性的M1GS核酶(M1GS-T_(436)),为今后进一步研究其胞内及体内抗病毒活性奠定了基础。

高吸附量纤维素膜的制备及其对Pb2+的吸附性能

以纤维素为原料,氢氧化钠、尿素、硫脲为溶剂体系制备纤维素膜,研究凝固浴的种类、H2SO4体积分数、凝固温度和凝固时间对纤维素膜吸附Pb2+的影响。采用准二级动力学模型研究吸附速率的快慢;采用SEM、比表面积和平均孔径、FTIR和XRD分析纤维素膜的结构和吸附机理;采用TG对纤维素膜的热性能进行分析。结果表明,以体积分数为7%的H2SO4为凝固浴、凝固温度为40℃、凝固时间为120min时,纤维素膜对Pb2+的吸附量达到最大,为343.0mg/g。纤维素膜吸附Pb2+符合准二级动力学模型。纤维素膜由表面致密变为含有孔洞的结构,吸附Pb2+后孔洞被填满,纤维素膜中的C=O键和N—H键与Pb2+产生螯合作用。纤维素膜中部分纤维素结晶型由Ⅰ型转变为Ⅱ型,结晶度降低;纤维素膜的热稳定性高于纤维素。