猪源抗菌肽PBD-1在毕赤酵母中的表达及鉴定

本试验旨在实现猪β防御素1(poricine-β-defensin 1,PBD-1)在毕赤酵母中的表达,获得有抗菌活性的抗菌肽PBD-1。根据PBD-1的氨基酸序列和酵母密码子偏好性,设计优化其核苷酸序列,利用SOE-PCR技术获得PBD-1基因序列,克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-PBD-1,经SacⅠ线性化后转入毕赤酵母SMD1168中。PCR筛选得到阳性酵母表达菌株,经甲醇诱导后得到分子质量约4.5ku的抗菌肽PBD-1。抗菌特性研究结果表明,表达产物抗菌肽PBD-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌均有较好的抑制效果。

梅山猪PBD-1基因CDS区克隆、组织表达及生物信息学分析

为系统探究猪β防御素-1(PBD-1)基因的结构和功能,以梅山猪为试验材料,扩增PBD-1基因CDS区,应用生物信息学分析猪PBD-1基因编码蛋白的特性和功能,运用DnaSP和MEGA分析猪PBD-1基因与其他物种进化关系,同时利用实时荧光定量方法检测PBD-1基因在梅山猪不同组织中的表达水平。结果表明:猪PBD-1基因CDS区长195bp,编码64个氨基酸,为脂溶性疏水性、不稳定的分泌型蛋白,无跨膜结构,存在信号肽区域(第1～22位氨基酸);该蛋白存在3个特异性蛋白质激酶的结合位点(PKC、PKA、UNSP),二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;包含defensin-beta保守结构域(第28～62位氨基酸),且该蛋白可能与PBD-2、CCR6、NPG1、PAMP-23、ZCCHC3等蛋白存在相互作用关系。进化分析显示,猪PBD-1基因与驴、驯鹿具有较高的同源性,可聚为一类。组织表达谱显示,PBD-1基因在梅山猪不同组织中均有表达,尤其在胃、免疫组织(胸腺、淋巴)及肠道组织(空肠、回肠)中呈现高表达。这一研究为今后深入研究PBD-1基因功能提供了理论参考。

猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体的构建

为构建猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体,采用PCR方法从质粒pcDNA3.1-BLG-HNP-1中扩增出山羊乳球蛋白(BLG)基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP-PBD-1构建成乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,鉴定。结果成功构建了乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1。乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1的成功构建,为进一步研究PBD-1蛋白的抗菌活性、抗菌机理及将进一步该载体应用于动物乳腺生物反应器的研究奠定基础。

猪PBD-1在4种器官组织中的表达

为了研究猪β-防御素-1(PBD-1)在肺、肝、睾丸和大脑中的表达情况。笔者采集健康公猪的肺、肝、睾丸和大脑组织,利用RT-PCR和免疫组织化学染色法分析PBD-1在不同组织中的表达情况。结果显示,PBD-1在公猪的肺、肝、睾丸和大脑4种组织中均有不同程度的表达,其中肺泡上皮、生精小管内部和大脑中的免疫阳性信号较多。PBD-1在公猪的4种器官组织中广泛分布,提示PBD-1不仅在抵御外界微生物感染中发挥作用,可能在其他生理活动中也发挥着重要的作用。

猪β防御素1基因在毕赤酵母中的分泌表达

PBD-1是猪防御系统起重要作用的抗菌小肽,为实现其在毕赤酵母中的表达,根据已发表的猪β防御素1(PBD-1)氨基酸序列和酵母偏好密码子,用PCR方法获得PBD-1基因,克隆到分泌型表达载体pPIC9K信号序列α因子之后,构建重组表达质粒pPIC9K-PBD-1,用SalⅠ将其线性化后转化毕赤酵母SMD1168,采用PCR法筛选Mut+表型,在AOX1启动子调控下,分子量约4.5kD的PBD-1抗菌肽得到表达。抗菌特性研究表明,该表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性。首次在毕赤酵母表达系统中实现了PBD-1的分泌表达。

猪β防御素-1的研究进展

猪β防御素-1(porcineβ-defensin 1,PBD-1)是广泛分布于猪消化道、呼吸道、肝肾等多种组织细胞内的一类活性多肽,在猪防御系统中有着重要的作用,大量研究结果证明PBD-1具有独特的作用机制,几乎无耐药性,已引起各国研究者的日益重视。目前对PBD-1科研工作在不断深入,可以相信PBD-1将在动物养殖、疾病预防和提高畜产品品质方面发挥重要作用。作者就PBD-1的分布、分子结构、抗菌作用机制和基因表达调控研究进展作一综述。

胶液法制备高顺式端羟基聚丁二烯液体橡胶

以工业顺丁胶原液为起始原料,先经氧化裂解反应制得醛基封端的聚丁二烯液体橡胶,再经还原反应制得了端羟基聚丁二烯液体橡胶.结果表明,反应过程中顺丁胶的微观结构未发生异构化,所得的端羟基聚丁二烯液体橡胶的顺式含量高(cis-1,4>95%);分子量通过控制氧化裂解反应物与丁二烯结构单元的化学计量比,在2200~7000间可调(~1H-NMR法);分子量分布指数维持在1.5~2.1范围;官能度(fn)在2.0左右.与阴离子聚合型丁羟胶和自由基聚合型丁羟胶相比,氧化裂解法制备的丁羟胶微观结构更规整,顺式含量更高,能够保持极低的玻璃化转变温度.此外,以工业顺丁胶原液为原料,既省去了顺丁块胶生产的水析凝聚、干燥压块等过程,又免去了胶块剪切破碎、溶胀溶解等过程,大幅度减少了能量消耗,且反应条件温和、可控、高效、经济,具有良好的工业化前景.