pBI121载体酶切位点添加及拟南芥Na^+/H^+逆向转运蛋白基因表达载体的构建

对pBI121载体GUS基因后的终止子序列(SacⅠ-EcoRⅠ)通过PCR扩增法进行了酶切位点的添加,即在SacⅠ后添加了XhoⅠ、在EcoRⅠ前添加了KpnⅠ。序列分析发现,两个酶切位点的添加是成功的,但扩增的终止子序列与原序列的同源性间有差异,即有4个碱基发生了变异,特别是第17个碱基位点出现了缺失。利用绿色荧光蛋白(GFP)对添加酶切位点载体进行了终止子活性的检测,结果发现,它与携带GFP的pBI121载体一样,GFP基因能正常表达,说明pBI121载体终止子序列酶切位点的添加是成功的。利用改造后的载体(pBI121-GZ)构建了CaMV35S启动子驱动AtNHX1基因的植物表达载体。

番茄果实特异表达载体pBI121-2A11-HB-1的构建及其对农杆菌的转化

为了解乙烯生物合成调控机理,本研究利用聚合酶链式反应技术,从番茄Micro-Tom中克隆2A11果实特异型启动子和LeHB-1基因,构建LeHB-1正义和反义果实特异表达载体,并导入根癌农杆菌GV3101中,为下一步通过转基因操作来研究转录因子LeHB-1在果实发育过程中的生物学功能奠定了实验基础。

重组质粒pBI190的构建

利用质粒pBI121为载体,通过对其酶切位点的改造,引入一个目的基因(204 bp),构建成一个新的质粒pBI190。方法:用Sac I和Xba I分别对质粒pBI121进行酶切,0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收所需片段,将已知DNA片段用引物进行PCR扩增后,使用T4 DNA连接酶将上述得到的DNA片段与酶切回收的质粒pBI121 DNA进行连接。结果:将连接产物转化大肠杆菌DH5α及筛选与测序公司进行鉴定,最终符合目的要求。结论:本实验将质粒pBI121进行了改造,构建了新的表达载体pBI190,并且分析了实验过程中遇到的相关问题。

木薯AGPase基因的克隆与载体构建

为了研究木薯淀粉合成酶关键基因AGPase在木薯淀粉合成中的作用,根据GenBank中其他物种AGPase小亚基基因序列,从高淀粉木薯‘辐选01’中克隆得到含3’末端的909bp的基因片段,回收克隆测序。结果显示,克隆获得片段与基因库中登录的蓖麻、毛果杨、甜橙、番薯、蜜柑、大豆同源性依次达到91%、91%、87%、86%、86%及85%。将阳性克隆与PBI121载体进行双酶切、连接,构建植物反义表达载体PBI121-AGPss,并将其导入农杆菌,得到农杆菌工程菌株。为进一步开展木薯淀粉合成相关的基因调控、转基因及基因功能研究奠定基础。

翅碱蓬CMO cDNA基因克隆、测序及重组植物表达载体的构建

从翅碱蓬叶片中提取总RNA,根据相关同源序列设计引物,使用反转录试剂盒进行RT- PCR,扩增得到翅碱蓬胆碱单加氧酶(CMO)cDNA,进行PCR产物测序;然后将CMO cDNA T-A克隆至pMD18-T-simple载体上,经测序正确后亚克隆至pBI121植物表达载体,进行酶切及克隆测序鉴定。

白颖苔草热激转录因子(HSF1)真核表达载体的构建

根据表达载体PBI 121特性及酶切位点设计合适的引物,由表达引物通过PCR技术从含有白颖苔草(Carex rigescens)CrHsf全长cDNA的克隆载体的大肠杆菌上扩增出带有特定酶切位点的CrHsf完整开放阅读框。再对载体和目的片段进行酶切处理,处理后将正确的目的基因片段亚克隆至PBI 121植物表达载体。通过PCR及酶切鉴定,结果证明,目的基因片段已被正确克隆到表达载体上,载体构建成功。

渗透胁迫相关基因高通量筛选技术体系的建立

随着功能基因组学的发展,在基因组水平上获得了大量渗透胁迫相关基因。农杆菌介导的超量表达是筛选和鉴定这些基因功能最为常用的技术。以植物表达载体pBI121为基础,在不改变其氨基酸序列的基础上通过定点突变消除了其上与质粒复制和稳定性有关的trfA基因(X00713)内部的SfiI酶切位点,并在表达单元CaMV35s启动子和NOS终止子之间引入了SfiIA和SfiIB位点,改造成通用植物表达载体卡盒pBHT-5。该载体卡盒可直接用于连接Clontech SMARTTM技术构建的cDNA文库,提高了大规模构建cDNA文库基因植物表达载体的工作效率。为高通量的筛选与鉴定基因功能,从大量的渗透胁迫相关基因中筛选出具有独立知识产权的、对植物抗渗透胁迫起重要作用的新基因奠定了坚实的基础。

甘蓝抗枯萎病基因FOC1植物表达载体构建及遗传转化

为研究甘蓝枯萎病抗性基因FOC1的抗性功能,利用前期克隆的FOC1基因,以pBI121质粒为植物表达载体,采用同源重组法构建FOC1基因的过表达载体;将构建好的重组质粒采用冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株中,并通过农杆菌介导的甘蓝外植体转化法对感病甘蓝进行遗传转化,利用载体特异引物对获得的转基因植株进行PCR鉴定。结果表明,最终成功构建FOC1基因的过表达载体pBI121-35S-FOC1,并已成功整合到受体甘蓝基因组中。

东方百合“元帅”查尔酮合酶基因表达载体构建

利用Genbank中公布的东方百合"元帅"查尔酮合酶cDNA序列,从东方百合"元帅"花瓣中扩增CHS1的cDNA开放阅读框,正向插入植物表达载体pBI121,并采用液氮冻融法将其转化到根癌农杆菌EHA105中。结果表明:经酶切和菌液PCR分析鉴定,获得与预期大小相符的1 200 bp片段,得到含有目的片段表达载体pBI121-CHS1的农杆菌菌株,可用于新铁炮百合的遗传转化。

新城疫病毒HN基因的克隆及在苜蓿中的表达

为了克隆新城疫病毒LaSota株HN基因,构建原核重组表达质粒pBI121-HN,使HN基因在苜蓿中表达,将新城疫病毒LaSota株接种于鸡胚,培养、纯化后收获鸡新城疫病毒,提取病毒RNA,经反转录后通过PCR扩增HN基因,克隆得到重组质粒pBI121-HN,并其通过电转化导入根癌农杆菌中,以根癌农杆菌为介导将HN基因导入苜蓿细胞。最终成功构建了重组表达质粒pBI121-HN,并通过根癌农杆菌转染苜蓿细胞将其在苜蓿中成功表达。本试验为家禽的植物性苜蓿疫苗的研究奠定了基础。

禽脑脊髓炎病毒VP1基因植物表达载体的构建

以提取的禽脑脊髓炎病毒总RNA为模板,以P1和P2为引物,反转录为cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增。将扩增产物克隆pMD18-T载体中,获得重组质粒pMD18-T-VP1,PstⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR确认正确后,利用pMD18-T-VP1重组质粒为模板,以P3和P4为引物,经PCR扩增获得了大小约810bp的产物。VP1基因和pBI121植物表达载体用SmaⅠ和SacⅠ双酶切,经纯化后连接,再转化到EHA105农杆菌中,酶切和测序鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒pBI121-VP1,为进一步利用转基因植物生产VP1蛋白奠定了基础。

根癌农杆菌介导载体pBI121转化少根根霉条件的研究

考察了脂肪酶生产菌株少根根霉N1023 G418的敏感性,结果表明,G418对少根根霉最小抑制浓度为500μg/mL。研究了不同条件对载体pBI121转化少根根霉的影响,结果表明,以根癌农杆菌LBA4404为介导菌,少根根霉N1023为受体菌株,G418为筛选标记的最佳转化条件为:乙酰丁香酮(AS)300μmol/L、根癌农杆菌的初始浓度OD600为0.6、共培养时间2 d。在此条件下pBI121对少根根霉的转化率达到112 cfu/106 cfu孢子。转化菌株经过5次连续培养后仍然稳定。通过上述研究,建立了根癌农杆菌介导载体pBI121转化少根根霉的方法。这是首次成功建立少根根霉的转化方法,为进一步的研究奠定了基础。

玉米谷氨酰胺合成酶c-DNA导入根癌农杆菌15955

用粘端连接法将构建于ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＦＤＢ２１３菌株中的玉米谷氨酰胺合成酶（ＭＧＳ）ｃ－ＤＮＡ亚克隆于由农杆菌质粒改造的ｐＢＩ１２１载体中。在测定的７２个转化菌中有７株（９．２％）插入ＭＧＳｃ－ＤＮＡ片段。亚克隆后的质粒ＤＮＡ用ＨｉｎｄＩＩ和ＢｓｔｘＩ酶解可确定其ｃ－ＤＮＡ片段的插入方向。结果显示，Ｐ９、Ｐ１５、Ｐ１６与Ｐ１７为正向插入，Ｐ２为反向插入的菌株。Ｐ１６质粒ＤＮＡ进一步用直接基因转化法——冻融法（Ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ）导入农杆菌１５９５５菌株。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法与ＤＮＡ杂交法测定表明，转化菌Ａ１１已携带ＭＧＳｃ－ＤＮＡ片段。

LMW-GS16基因表达载体的构建

采用PCR方法对来自大麦的LMW-GS16基因进行修饰,在基因5′及3′端分别加入构建表达载体所需的BamHⅠ和SacⅠ限制酶切位点,并将其连接在相应酶切的质粒pBI121上,构建成LMW-GS植物表达载体pBI121-16。重组质粒转化到E.coliDH5α和农杆菌LBA4404中,通过Kanamycin筛选阳性克隆,用PCR方法进行鉴定。对照组转化率为零,转化组阳性克隆特异地扩增出900 bp片段,与目标基因DNA大小一致,转化率为1.0×106/μg DNA。

狂犬病病毒N基因植物表达载体的构建

以提取的狂犬病病毒总RNA为模板,以N1和N2为引物,反转录为cDNA,然后再以cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至质粒pMD18-T中,获得重组质粒pMD18-T-N,采用HindⅢ和BamHⅠ双酶切法及PCR确认正确后,利用pMD18-T-N重组质粒为模板,以N3和N4为引物,成功构建了重组植物表达载体pBI121-N。

水稻精细胞优势表达基因RSSG58的启动子克隆和功能鉴定

利用本实验室已经克隆的水稻精细胞优势表达基因RSSG58的cDNA序列与NCBI中的粳稻基因组文库进行比对、定位,结合生物信息学方法分析预测基因上游的启动子序列.在此基础上设计引物,以粳稻Oryzasativa(japonicacultivar-group)日本晴黄化苗总DNA为模板,采用DNA聚合酶链式反应(PCR)的方法扩增出基因上游1093bp和462bp两个不同长度的启动子缺失片段(分别命名为JP58B和JP58S),测序结果显示,其具有大多数高等植物启动子的保守元件.进一步构建启动子片段的植物表达载体pBI121-JP58B和pBI121-JP58S,瞬时表达结果显示,两个启动子片段对报告基因GUS均具有启动活性.

杜氏盐藻MAPK基因植物表达载体的构建及对烟草的转化

以载体pBI121为基础,经SmaI和BamHI单酶切后,构建了植物表达载体pBI121-MAPK,并通过农杆菌介导采用叶盘转化法将其转入烟草中,经卡那霉素抗性筛选,获得转基因抗性植株。经PCR检测表明pBI121-MAPK已整和到烟草基因组中。

马尾松纤维素合成酶基因PmCesA2的克隆及其植物表达载体的构建

为了探究马尾松木材形成的分子机制,以马尾松嫩枝的总RNA反转录得到的cDNA为模板,利用反转录PCR和RACE技术克隆得到马尾松CesA2基因的全长cDNA序列(命名为Pm Ces A2),序列长度为3 500 bp,包含一个长为3 174 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码1 057个氨基酸。序列分析表明:PmCesA2序列与已报道的火炬松Ces A2基因(AY789651.1)的相似性达98%。将全长基因克隆到载体p BI121质粒的Sna BI,Sac I双酶切位点之间,构建正义表达载体p BI121-PmCesA2。

枯草芽孢杆菌突变株proBA基因植物表达载体的构建及转基因拟南芥的耐盐性能初探

从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)抗脯氨酸结构类似物突变株中克隆得到脯氨酸合成途径中的关键酶基因proB(编码γ-谷氨酰胺激酶)和proA(编码谷氨酰胺-γ-半醛脱氢酶),同时设计引物从拟南芥基因组中扩增得到吡咯啉-5-羧酸合成酶B基因(p5csB)的第一个内含子序列,将其分别与proB和proA基因通过PCR拼接后,酶切连接构建得到植物双元表达载体pBI121pro。以LBA4404为介导,采用真空抽滤的方法转化得到转proBA基因拟南芥;第三代的纯合子(T3)通过半巢式PCR的方法验证外源基因已整合到拟南芥基因组中,GUS活性分析表明外源基因在叶片中表达最强,茎部其次,根部最弱;对600mmol.L-1致死浓度NaCl耐受能力的分析表明,转基因拟南芥的平均存活时间(37.8min)明显高于野生型拟南芥(26min)。

烟草反义Mlo基因表达载体的构建

获得烟草反义Mlo基因的植物表达载体pBI 121-Mlo,为进行烟草遗传转化,获得该基因表达的缺陷型植株打下基础.从烟草叶片中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到Mlo基因的c DNA,以此为模板设计反义引物,通过PCR扩增出反义Mlo基因,将此反义Mlo基因与T载体连接,测序正确后再将此反义片段与植物表达载体pBI 121连接,构建烟草反义Mlo基因的植物表达载体pBI 121-Mlo.经Kan选择筛选出反义重组菌落,碱裂解法小量提取质粒后,用Xba I和Bam HI双酶切后再进行电泳鉴定.结果表明,目的基因已与植物表达载体pBI 121连接成功.成功构建了烟草反义Mlo基因表达载体pBI 121-Mlo.