新型PBK/TOPK抑制剂OTS514的合成

以3-溴噻吩-2-甲酸为起始原料,经酰氯、卤代、酰胺化、氨基保护、分子内环化、溴代得中间体9-溴-8-甲氧基-6-甲基噻吩并[2,3-c]喹啉-4(5H)-酮;以(R)-2-苯基丙胺盐酸盐为原料,经中和游离、酰化保护、溴代、水解去保护、氨基Boc保护、亲核取代得到(R)-(2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二恶硼烷-2-基)苯基)丙基)氨基甲酸叔丁酯; 2个中间体经交叉偶联反应、脱保护得OTS514,纯度99.1%,总收率为24.7%,并采用1H NMR、13C NMR和MS进行其结构确证。该合成路线反应条件温和,适合于实验室研究的小规模制备。

抗肿瘤药物：PBK/TOPK抑制剂的研究进展

PBK/TOPK是一种丝-苏氨酸蛋白激酶,正常生理情况下,TOPK仅在睾丸和胸腺中表达。近年来研究表明,TOPK在多种恶性肿瘤细胞中呈高表达,调控肿瘤细胞的细胞周期,与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、抗凋亡过程相关。因此,TOPK成为肿瘤治疗的一个靶标,其特异性抑制剂正在研究当中。目前,使用最多的TOPK抑制剂均能与TOPK分子活性中心结合,直接抑制TOPK的功能,从而达到抑制效果。本文综述了TOPK的结构和功能,以及现用于研究的TOPK抑制剂的抗肿瘤作用。

新型TOPK抑制剂的设计、合成及抗肿瘤活性研究

目的将TOPK抑制剂OTS514的母核噻吩并[2,3-c]喹啉酮环替换成喹唑啉,探究含有喹唑啉的新型TOPK抑制剂的抗肿瘤细胞增殖活性。方法以OTS514作为先导化合物设计并合成一系列4-氨基喹唑啉衍生物。采用MTT法测试目标化合物对肺癌细胞(A549)和乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的抗增殖活性。结果合成了16个未见报道的新化合物,其结构经1H NMR和高分辨MS确证。手性因子对抗肿瘤活性影响不明显,暴露的氨基能增强化合物的抗肿瘤活性。体外抗肿瘤实验表明,化合物12a-12f的活性与OTS514相当。结论新骨架的TOPK抑制剂具有和OTS514相当的抗肿瘤活性,为进一步探索含有喹唑啉药效团的TOPK抑制剂研究打下了基础。

TOPK抑制剂HI-TOPK-032对胰腺神经内分泌肿瘤BON-1细胞体外恶性表型的影响

目的杀伤性T细胞来源的蛋白激酶(T-lymphokine activated killer cell-originated protein kinase,TOPK)高表达与肿瘤增殖、凋亡、侵袭和转移密切相关。本研究旨在探讨使用TOPK抑制剂HI-TOPK-032对胰腺神经内分泌肿瘤细胞BON-1体外恶性表型的抑制作用。方法通过蛋白免疫印迹实验检测人正常胰腺导管上皮细胞和不同胰腺肿瘤细胞系中TOPK的蛋白表达水平;CCK-8实验检测HI-TOPK-032对BON-1细胞增殖的影响;克隆形成实验检测HI-TOPK-032对BON-1细胞体外克隆形成的影响;Transwell实验检测HI-TOPK-032对BON-1细胞迁移和侵袭能力的影响;流式细胞仪检测HI-TOPK-032对BON-1细胞周期的影响;Annexin V检测HI-TOPK-032对BON-1细胞凋亡和坏死的影响。结果与正常胰腺导管上皮细胞相比,胰腺神经内分泌肿瘤细胞BON-1中TOPK蛋白表达显著上调;在体外实验中,与对照组相比,在含1、2.5、5μmol/L浓度的HI-TOPK-032培养基中,BON-1细胞增殖能力依次减弱(22.2±8.2)%、(90.4±1.0)%、(89.7±0.9)%(P<0.001),克隆形成依次减少(19.1±2.1)%、(42.5±5.7)%、(87.0±5.6)%(P<0.001),迁移能力依次减弱(9.3±5.6)%、(70.5±4.0)%、(87.5±3.5)%(P<0.01),侵袭能力依次减弱(23.0±4.2)%、(60.7±5.4)%、(93.6±3.0)%(P<0.01);在含2.5、5μmol/L浓度HI-TOPK-032培养基中,G0/G1期的BON-1细胞比例分别增加(12.2±2.0)%、(18.3±1.4)%(P<0.001),在5μmol/L浓度时,S期的细胞比例减少(18.4±6.1)%(P<0.01),在2.5、5μmol/L浓度时,G2/M期的细胞比例分别减少(17.6±8.6)%、(16.4±4.5)%(P<0.001);HI-TOPK-032促进BON-1细胞凋亡和坏死,凋亡依次增加(60.6±30.9)%、(79.5±27.5)%、(165.8±34.9)%(P<0.05),5μmol/L浓度时,坏死显著增加,增加(385.8±67.3)%(P<0.001)。结论TOPK靶向抑制剂HI-TOPK-032显著抑制BON-1细胞的体外恶性表型,抑制效果呈剂量依赖式。HI-TOPK-032能调控BON-1细胞周期,促进凋亡和坏死。TOPK抑制剂HI-TOPK-032可能在胰腺神经内分泌肿瘤的靶向治疗中发挥重要作用。

PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂对体外培养血管瘤内皮细胞的影响

目的以PI3K/Akt/mTOR信号转导通路为靶点,观察PBK抑制剂LY294002和mTOR抑制剂RAD001对体外培养血管瘤内皮细胞增殖与凋亡的影响,并检测PI3K/Akt/mTOR信号轴中效应分子以探讨血管瘤消长的分子机制。方法采用组织块结合酶消化法培养血管瘤内皮细胞、传代培养,并用第Ⅷ凝血因子相关抗原对其鉴定。待细胞处于对数生长期,使用无血清培养孵育48h行同步化处理后,分别加入RAD001、LY294002及RAD001+LY294002作为干预组,加入完全内皮细胞培养基作为空白对照组。以上4组继续孵育24h后收集细胞,采用蛋白免疫印迹方法检测各组细胞p-Akt、p-mTOR、p-ERK及p-eIF4E蛋白的表达,流式细胞仪检测各组细胞的周期分布及凋亡率;分析p-Akt、p-mTOR、p-ERK及p-eIF4E蛋白的表达水平与血管瘤内皮细胞周期及凋亡变化的相关性。结果1.RAD001、LY294002及RAD001+LY294002干预24h后,内皮细胞凋亡率分别为(13.80±1.73)%、(15.03±1.05)%、(36.06±2.67)%,较对照组(3.90±0.2b)%有明显升高,差异具有统计学意义(￡=一9.82,一18.03,一20.82,P<O.01),且RAD001+LY294002组凋亡率显著高于对照组、LY294002组、RAD001组(t=一20.82,一12.12,一12.7,P<O:01);G0/G1期细胞比例分别为(74.29±1.59)%、(74.57±0.59)%、(82.28±3.01)%,较对照组(67.15±1.49)%有明显升高,差异具有统计学意义(t=一5.67,一8.02,一7.79,P<0.01),且RAD001+LY294002组高于对照组、LY294002组、RAD001组(t=一7.79,一4.35,一4.06,P<0.05)。2.蛋白免疫印迹检测显示,RAD001干预后,p-Akt、p-ERK、p-eIF4E蛋白表达分别为(O.75±0.04)、(0.54±0.08)、(1.50±0.34),较对照组(0.43±0.08)、(0.27±0.04)、(0.84±0.17)增加,差异具有统计学意义(t=一6.13,一5.49,一3.03,P<O.05);p-mTOR(O.40±0.04)比对照组(0.77±0.07)明显降低,差异具有统计学意义(t=7.91,P<0.01)。LY294002干预后,p-Akt、p-ERK、p-eW4E、p-耐r0R蛋白表达分别为(0.31±0.08)、(0.26±0.04)、(O.78±0.18)、(0.42±0.05),与对照组比较,蛋白表达有一定下降趋势,但差异无统计学意义(t=2.01、0.23、0.41、6.75,P>0.05);RAD001+LY294002干预后,p-Akt、p-ERK、p-eIF4E、p-mTOR蛋白表达分别为(O.32±0.09)、(0.23±0.04)、(0.50±0.13)、(O.27±0.03),与对照组比较,p-eIF4E、p-mTOR蛋白表达下降,差异有统计学意义(t=2.77、10.97,P<O.05),p-Akt、p-ERK蛋白表达差异无统计学意义(t=1.70、1.10,P>O.05),与LY294002组,p-mTOR蛋白表达下降,差异有统计学意义(t=4.42,P<0.05),p-Akt、p-ERK、p-eIF4E蛋白表达无统计学意义(t=一0.15、0.92、2.16,P>0.05),与RAD001组比较,均有明显降低,差异具有统计学意义(t=7.37、6.47、4.75、4.87,P<O.01)。结论mTOR抑制剂RAD001可引起p-Akt、p-ERK及p-eIF4E的负反馈激活;RAD001+LY294002对体外培养血管瘤内皮细胞的干预效果优于单独使用RAD001或LY294002,且可避免RAD001引起的负反馈激活。