淋巴因子对人PBMNC的LAK细胞形成、增殖和细胞毒作用的影响

应用乳酸脱氢酶释放法对重组白介素２，粗制天然白介素２，重组肿瘤坏死因子和天然免疫活性肽等淋巴因子诱导人ＰＢＭＮＣ为ＬＡＫ细胞以及ＬＡＫ细胞对靶细胞（人外周血淋巴细胞，人食管癌１０９细胞株和人红白血病细胞株＿（５６２）的细胞毒作用分别于培养的第４ｄ和第７ｄ进行了检测。结果显示：①四个配伍组和一个重组白介素２组的多克隆ＬＡＫ细胞攻击溶解１０９细胞株和Ｋ＿（５６２）细胞株的水平波动子２８％和６６％之间，中位数为４７％，而对正常人外周血淋巴细胞均无细胞毒作用；②重组白介素２和粗制天然白介素２配伍培养ＬＡＫ细胞的增殖协力约高于重组白介素２和重组肿瘤坏死因子组，以及重组白介素２和免疫活性肽组增殖协力的３倍，③在诱导ＬＡＫ细胞的过程中其增殖量和其细胞毒活性可以不同步。建议临床上治疗晚期肿瘤病人除用ＬＡＫ细胞和重组白介素２外，首先选用天然白介素２。

SAA患者PBMNCs对正常CFU-GM的抑制与免疫抑制治疗疗效的关系

目的：探讨严重型再生障碍性贫血（SAA）患者外周血单个核细胞（PBMNCs）对正常造血的抑制及其与免疫抑制剂治疗疗效的关系。方法；采用造血祖细胞半固体琼脂培养法，在正常人粒-巨噬细胞集落形成单位（CFU－GM）培养体系中加入SAA患者的PBMNCs。结果：35例SAA中，62.9％患者的PHMNCs对正常人CFU－GM生长具有明显抑制作用，该组患者的环孢霉素A（CsA）治疗有效率达77.3％，明显高于PBMNCs对正常CFU-GM不产生抑制作用患者的CsA治疗有效率（30．8％）。结论：PBMNCs对正常人CFU－GM生长具有抑制作用的SAA患者免疫抑制治疗疗效较好,SAA患者PBMNCs对正常CFU-GM的抑制试验可作为预测SAA免疫抑制治疗疗效的简便方法。

SRBC膜提取物及其对猪PBMNC激活作用的研究

胰酶水解绵羊红细胞（ＳＲＢＣ）膜得到粗提物，经离子交换层析部分纯化后，获得组分ＴＲＦ－Ⅲ（Ｔｒｙｐｓｉｎ－ｒｅｌｅａｓｅｄｆｒａｅｔｉｏｎⅢ）具有明显抑制ＳＲＢＣ与猪外周血淋巴细胞形成Ｅ玫瑰花的活佐，花环形成率与ＴＲＦ－Ⅲ含量有明显的函数关系。电泳测定其分子量为６６ｋＤ。ＴＲＦ－Ⅲ单独作用尽管对ＰＢＭＮＣ的增殖无作用，但可增强ＰＨＡ刺激ＰＢＭＮＣ的增殖作用，ＴＲＦ－Ⅲ单独作用于ＰＢＭＮＣ可显著增强后者的促凝血活性，与正常相比，促凝率约增加３０％，与ＰＨＡ促凝率（３３％）相似。结果提示，ＴＲＦ－Ⅲ具有Ｅ受体配体促淋巴细胞激活作用。

抗CD3单抗对再障病人PBMNC分泌TNF－α和IL－6的影响

抗ＣＤ３单抗体外培育再障患者治疗前后（ｎ＝２０）和正常人（ｎ＝２０）的外周血单个核细胞，设ＰＨＡ组、抗ＣＤ３组、ＰＨＡ＋抗ＣＤ３组和空白组，发现：治疗前，６／２４例再障存在ＴＮＦα自发分泌，ＰＨＡ刺激后，再障组ＴＮＦα分泌量显著高于正常人；体外抗ＣＤ３抑制ＴＮＦα的自发分泌和ＰＨＡ的诱导分泌；抗ＣＤ３治疗后，单个核细胞对ＰＨＡ的促分泌作用处于无应答状态；抗ＣＤ３促进ＩＬ－６的分泌。结果表明，再障时ＴＮＦα分泌异常，抑制ＴＮＦα和促进ＩＬ－６分泌可能是抗ＣＤ３重要的治疗机制。

SRBC膜提取物对猪PBMNC第二信使的影响

胰酶水解绵羊红细胞（ＳＲＢＣ）释放膜表面活性蛋白组分Ⅲ（ＴＲＦ－Ⅲ），单独作用可使猪外周血单个核细胞（ＰＢＭＮＣ）胞内ｃＡＭＰ水平升高，以１００μｇ／ｍｌ浓度刺激达最高峰，由对照组０．９４±０．１４ｐｍｏｌ／Ｌ升高到２．７５±０．２５ｐｍｏｌ／Ｌ（Ｐ＜０．０１）。如果ＰＢＭＮＣ事先与腺苷酸环化酶（ＡＣａｓｅ）抑制剂ＬｉC１孵育后再以ＴＲＦ－Ⅲ或ＰＡＨ刺激。ｃＡＭＰ增高受到抑制（Ｐ＜０．０１）；而ＥＤＴＡ－２Ｎａ（一种磷酸二酯酶ＰＤＥ抑制剂）对此ｃＡＭＰ升高无影响。结果提示，此ｃＡＭＰ升高主要是通过活化ＡＣａｓｅ水解ＡＴＰ生成ｃＡＭＰ，而不像是抑制ＰＤＥ减少ｃＡＭＰ降解引起的。ＴＲＦ－Ⅲ诱导猪ＰＢＭＮＣ胞内Ｃａ^(２＋)浓度升高，以１００μｇ／ｍｌ刺激２分钟升高最多，由对照组的２４２±７ｎｍｏｌ／Ｌ升高到３２３±１５ｎｍｏｌ／Ｌ（Ｐ＜０．０１）。以ＥＧ－ＴＡ除去胞外Ｃａ^(２＋)再以ＴＲＦ－Ⅲ或ＰＡＨ刺激，仅观察到小范围［Ｃａ^(２＋)］ｉ升高。看来这一过程包括了刺激胞内Ｃａ^(２＋)释放和胞外Ｃａ^(２＋)内流两种方式。以上结果证明，ＴＲＦ－Ⅲ对淋巴细胞功能影响与细胞内第二信使有关。

髓磷脂碱性蛋白促进单个核细胞对内皮细胞的粘附效应

目的 :探讨MBP对外周血单个核细胞 (PBMNC)与人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)粘附性的影响 ,以揭示中枢神经系统 (CNS)炎症时PBMNC进入CNS的可能原因。方法 :用细胞粘附试验 ,研究PBMNC与HUVEC的粘附性 ,用细胞免疫化学法、FACS分别观察VCAM 1和ICAM 1的表达。结果 :MBP活化的PBMNC与MBP刺激的PBMNC培养上清作用的HUVEC的粘附性较对照有显著提高。ICAM 1单抗和可溶性VCAM 1(sVCAM 1)可抑制二者间的粘附。进一步证明该上清可诱导HUVEC表达VCAM 1并可提高ICAM 1的表达量 ,MBP可刺激PBMNC产生TNF ,后者刺激HUVEC产生ICAM 1和VCAM 1,从而促进PBMNC与HUVEC的粘附。结论 :MBP可促进PBMNC与HUVEC的粘附 ,因此在CNS炎症时MBP对PBMNC进入CNS可能起重要作用。

再生障碍性贫血患者外周血单个核细胞产生某些细胞因子能力的变化及意义

观察再生障碍性贫血患者外周血单个核细胞（ＰＢＭＮＣ）产生 ＩＬ－１α、ＩＬ－２的能力及外周血清ｓＩＬ－２Ｒ水平，探讨这些变化的意义。方法：应用ＥＬＩＳＡ法测定细胞因子活性。结果〔显示再障患者ＰＢＭＮＣ产生ＩＬ－１α的能力明显低于对照组（Ｐ＜０．０１）；而产生 ＩＬ－２的能力则明显高于对照组（Ｐ＜０．０１）；血清 ｓＩＬ－２Ｒ水平明显高于对照组（Ｐ＜０．０１）。结论：这三项检测结果对于认识再障贫血的发病机制、辅助诊断疾病的严重程度、指导治疗和估计预后有一定意义。

慢性粒细胞白血病树突状细胞的体外定向诱导扩增及鉴定

目的 体外定向诱导扩增慢性粒细胞白血病 (CML)患者外周血单个核细胞 (PBMNC)来源的树突状细胞 (CML -DC)并测定其表型。方法 取CML患者新鲜抗凝血 ,用淋巴细胞分离液分离PBMNC ,经细胞因子rhGM-CSF、rhIL - 4、rhTNF -α联合刺激培养 9～ 12d ,收集培养细胞 ,光镜形态学分析并细胞计数 ,结合PE -CD1a单抗、FITC -CD14单抗在流式细胞仪 (FCM)上进行CML -DC比例及表型分析。结果 CML患者PBMNC经以上细胞因子联合培养 ,CML -DC含量可达 3.5 %～ 2 3.5 % ,而新鲜分离的CML患者PBMNC中CML -DC含量仅为0 .1%～ 1%。结论 CML患者PBMNC经体外定向诱导扩增培养可以生成较多的CML -DC ,从而为CML的免疫治疗应用于临床提供了基础。

碘对自身免疫性甲状腺疾病外周血单个核细胞HLA-DR表达的影响

目的 :探讨碘在自身免疫性甲状腺疾病 (AITD)发病中的作用及机制。方法 :选择具有遗传倾向疾病Graves病一级亲属的外周血单个核细胞 (PBMNC) ,采用细胞培养和免疫印迹技术 ,检测 Na I对 PBMNC HL A - DR表达的影响。结果 :Graves病一级亲属 :PBMNC HL A- DR表达量随培养液 Na I浓度增加而递增 ;而对正常无遗传倾向者 PBMNC HL A- DR表达量无影响。结论 :过多的碘可以上调有遗传倾向者 PBMNC HL A- DR表达。

rhTPO对巨核系的定向分化效应

目的 :探讨重组人促血小板生成素 (rhTPO)对外周造血干细胞中巨核系祖细胞的定向诱导分化能力。方法 :经化疗及G CSF动员后分离的外周造血干细胞 ,进行液体和集落培养 ,研究rhTPO单独及与IL 3、IL 6、SCF的协同作用。结果 :液体培养后 ,TPO组单个核细胞数 (MNC)扩增了 ( 1.73± 0 .49)倍 ,IL 3 +IL 6 +SCF组MNC比种植时增加 ( 4.2 0± 1.14)倍 ,IL 3 +IL 6+SCF +TPO组MNC增加了 ( 4.5 3± 1.2 7)倍。单独应用TPO及TPO与IL 3、IL 6、SCF合用产生高比例的CD41a +细胞 ,TPO组培养前CD41a+细胞为 11.70 %± 5 .2 3% ,培养后CD41a +细胞为 19.17%± 6 .2 6 % ( P <0 .0 5 )。CD41a+细胞数在TPO组扩增了 ( 3.5 2± 1.18)倍 ,IL 3+IL 6 +SCF组扩增了 ( 5 .32± 1.79)倍 ,IL 3 +IL 6 +SCF +TPO组扩增了 ( 6 .94± 2 .19)倍。结论 :TPO可以定向诱导巨核系细胞的分化 ,IL 3、IL 6、SCF可以协同TPO的作用 ,这在造血调控研究 ,体外定向扩增外周血干细胞 。

LMP2混合肽负载树突状细胞与EB病毒感染患者外周血单个核细胞共培养产生识别EB病毒抗原的T细胞

LMP2是EB病毒感染细胞后表达的一种蛋白。本研究探讨应用适于不同HLA分型的EB病毒-LMP2抗原混合肽(MIX-LMP2)体外刺激EB病毒感染患者外周血单个核细胞,诱导产生EB病毒抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。取EB病毒相关噬血细胞综合症患者的外周血,分离并诱导培养树突状细胞,在培养过程中用EB病毒MIX-LMP2混合肽刺激,促成熟后在体外激活自体T淋巴细胞,每周刺激1次,共刺激2次;同时对部分分离的淋巴细胞在培养过程中不予以刺激作为对照。用基因扫描T细胞受体(TCR)β基因图谱的方法观察培养前后的T细胞克隆分布变化;用流式细胞术检测T淋巴细胞的表型变化;将培养的细胞和靶细胞共培养检测IFN-γ的分泌以研究CTL细胞抗原特异性的细胞毒作用。研究结果表明,基因扫描TCRβ基因结果显示体外培养改变了患者的TCRβ基因图谱,培养前为寡克隆的TCRβ基因家族在培养后出现与正常人相似的多峰分布,提示淋巴细胞亚群分布恢复正常;流式细胞分析显示培养前的淋巴细胞CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD45RA-CD45RO+比例分别为70.73%、42.99%、27.56%,用负载EB病毒LMP2肽2次刺激体外培养后,上述的淋巴细胞表型分别升高为95.17%、52.54%、81.41%。NK细胞(CD3-CD56+)、调节性T细胞(CD4+CD25+FOXP3+)比例变化不大,分别从培养前的2.12%,0.03%变化为2.35%,0.02%。CD3+CD45RA-CD45RO+细胞增长比例较大,表明2次刺激后大部分的初始型T淋巴细胞被激活。IFN-γ分泌检测结果显示,当负载LMP2肽的DC细胞作为靶细胞时,刺激1次的细胞分泌IFN-γ量和刺激2次的细胞分泌IFN-γ量明显高于同期未刺激细胞分泌IFN-γ量(p<0.05)。而对于未负载LMP2的DC细胞作为靶细胞时,IFN-γ检测结果则显示无统计学意义(p>0.05)。结论:用负载EB病毒MIX-LMP2肽的树突状细胞(DC)刺激T淋巴细胞的培养方法,可以改变患者T淋巴细胞克隆分布,产生识别EB病毒的特异性T淋巴细胞。

CpG ODN 2216对白血病缓解期患者外周血单个核细胞的活化能力及活化的细胞对K562细胞的杀伤作用

本研究探讨CpG ODN 2216对白血病缓解期患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMNC)的活化能力以及CpG ODN 2216活化的PBMNC对白血病细胞K562的杀伤作用。取白血病缓解期患者外周血,以淋巴细胞分离液(Ficoll)分离PBMNC,用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整PBMNC浓度为2.0×106/ml。对照组加入生理盐水(NS),实验组加入CpG ODN 2216,培养1周,提取上清,用ELISA检测上清中IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10的水平。取白血病缓解期患者外周血,分离PBMNC,对照组加入生理盐水,实验组加入CpG ODN 2216,培养48小时,用流式细胞仪检测PBMNC中淋巴细胞的Th1/Th2,Tc1/Tc2细胞比例;流式细胞术检测活化的PBMNC对肿瘤细胞K562的杀伤能力。结果表明:实验组上清中IFN-γ、IL-12水平与对照组相比有显著差异(p<0.01);IL-4、IL-10水平与对照组相比无明显差异(p>0.05)。CpG ODN 2216能刺激白血病缓解期患者PBMNC向Th1/Tc1转化,与对照组相比有显著差异(p<0.01),但对Th2/Tc2无明显的刺激作用(p>0.05)。CpG ODN 2216活化的PBMNC对K562细胞的杀伤能力明显高于对照组(p<0.01)。结论:CpG ODN 2216可在体外诱导白血病缓解期患者PBMNC分泌Th1型细胞因子,诱导PBMNC向Th1方向转化,并强烈地活化CD8+T细胞应答。CpG ODN 2216活化的PBMNC对白血病细胞K562具有较强的杀伤作用。

脐血CD34＋细胞和外周血单个核细胞中HOXB4基因表达及其启动子区CpG岛甲基化状态的研究

本研究旨在通过检测脐血CD34+细胞和正常人外周血单个核细胞(PBMNC)中HOXB4基因表达水平及其启动子区CpG岛的甲基化水平,初步探讨造血系统中HOXB4基因的表达水平与其启动子区甲基化的相关性。采用半定量RT-PCR检测脐血CD34+细胞和PBMNC中HOXB4基因的表达,应用亚硫酸氢盐测序法检测这两种细胞中HOXB4基因启动子区CpG岛的甲基化位点。结果发现,CD34+细胞高表达HOXB4,HOXB4基因启动子区CpG岛未发生甲基化;PBMNC不表达HOXB4,HOXB4基因启动子区在ATG上游-129bp的C碱基发生甲基化。结论:HOXB4基因启动子甲基化程度是其基因表达水平的负性调节机制之一。HOXB4在CD34+细胞中的高表达与其基因启动子低甲基化有关,而HOXB4在PBMNC中的基因沉默则可能与其启动子区的甲基化密切相关。初步筛选出的HOXB4基因启动子区CpG岛甲基化位点,为后续研究奠定了基础,也为扩增造血祖细胞提供一条新途径。

多囊卵巢综合征患者外周血单个核细胞中RPS 26及PPARγ基因的表达

目的探讨外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMNC)中核糖体蛋白(ribosonoal protein S 26,RPS 26)和卵巢颗粒细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)基因表达与多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)患者病情的相关性。方法将深圳市龙华新区人民医院妇科2015年7月至2016年3月诊治的38例PCOS患者作为PCOS组,同期体检健康女性30例作为对照组,抽取外周血,采用Ct值比较法,通过SYBR Green II实时定量PCR检测两组PBMNC中RPS 26及PPARγ基因在mRNA的表达水平,进一步分析PCOS患者两基因表达水平及与体质量指数(body mass index,BMI)、性激素水平相关性。结果 PCOS组RPS 26表达水平高于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05),PCOS组PPARγ基因表达明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。RPS 26及PPARγ基因表达水平与睾酮呈正相关(P<0.05),与促卵泡成熟素呈负相关(P<0.05)。结论 RPS 26及PPARγ基因在PCOS患者PBMNC中的表达均高于正常女性,可不同程度地反映疾病的严重程度。