肺炎链球菌PBP1a、PBP2b基因突变分析

目的了解肺炎链球菌(SP)青霉素结合蛋白编码基因(PBPs基因)的突变状况。方法对1株青霉素低耐药株(MIC 1.5μg/ml),苯唑青霉素耐药株(K-B法,D=6 mm),TEM、SHV基因为阴性的SP(SR019),经PCR检测PBP1a、PBP2b,扩增产物全自动DNA测序,并与SPR6株(青霉素敏感株)DNA序列相比较。结果SR019的PBP1a、PBP2b基因均存在突变,基因突变率分别为21%和13.6%。结论耐青霉素SP存在PBP1a、PBP2b基因突变。

肺炎链球菌pbp2b和pbp1a基因突变与青霉素耐药的相关性研究

目的探讨耐青霉素肺炎链球菌pbp2b和pbp1 a基因的突变与青霉素耐药的关系,为明了肺炎链球菌的耐药性变异机制,防治其感染提供实验依据。方法从呼吸道感染患儿痰标本中分离肺炎链球菌163株,液体培养基连续稀释法测定其对青霉素的最小抑菌浓度(M IC),套式聚合酶链反应(nPCR)扩增pbp2b和pbp1 a基因,扩增产物直接DNA测序,所测序列与青霉素敏感株(SPN R6)的基因序列进行比较,并分析其氨基酸结构的改变。结果 163株肺炎链球菌中检出青霉素敏感菌75株,中度敏感17株,青霉素耐药菌71株(44%)。耐药菌中58株存在pbp2b突变(81.7%),其中,56株为点突变,2株为CCT插入突变;在27株有pbp2b基因突变的B型和C型耐药菌中,21株出现了不同程度的pbp1 a基因突变。PBP2B氨基酸结构改变以苏氨酸变为丙氨酸、精氨酸变为赖氨酸为主,PBP1A以丙氨酸变为苏氨酸、谷氨酸变为天门冬氨酸为主。结论肺炎链球菌的pbp2b和pbp1 a基因突变与对青霉素的耐药性密切相关,PBP2b突变导致低水平耐药;PBP2b和PBP1A突变导致高水平耐药。

泛耐药鲍曼不动杆菌PBP1A、CarO及β-内酰胺酶的编码基因分析

目的了解一株泛耐药鲍曼不动杆菌（js01株）可能存在的β-内酰胺类药物耐药机制。方法对自2011年12月宁波市第一医院住院患者的痰样本js01株分离，用gyrA和parC基因PCR扩增、测序和BLASTn比对确认菌种。用PCR法分析33种β-内酰胺酶基因（13种A类酶基因、10种B类酶基因、2种C类酶基因、8种D类酶基因）和插入序列与β-内酰胺酶编码基因连锁检测以及CarO膜孔蛋白编码基因。再用分段PCR法扩增PBP1A编码基因，双向测序后拼接成全长序列。结果js01株检出β-内酰胺酶TEM-1、ADC-30、OXA-23和OXA-66编码基因。插入序列与β-内酰胺酶编码基因连锁检测显示ISabal-ADC-30和ISabal—OXA-23为阳性。js01株carO基因序列与鲍曼不动杆菌敏感株（SDF）相比存在有义突变，氨基酸序列一致率为76．0％（189／249），存在3个氨基酸缺失。is01株PBP1A编码基因序列与SDF株相比存在有义突变，氨基酸序列的一致率为99．6％（848／851），存在3个氨基酸变异，但js01株PBP1A蛋白分子立体结构比SDF株丢失2个螺旋结构。结论本株鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类药物耐药主要与该菌株管家基因（PBP1A、CarO编码基因）突变与可移动遗传元件介异的β-内酰胺酶编码基因有关。

肺炎链球菌pbp1a基因重组原核表达质粒的构建与鉴定

目的构建肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pneumoniae)pbp1a基因重组的原核表达质粒,并进行鉴定。方法化学合成S.pneumoniae含STMK区的pbp1a基因片段,PCR扩增后,与pUC19载体连接,构建重组表达质粒pUC19-pbp1a,转化耐青霉素的pbp1a基因突变的S.pneumoniae,测定青霉素对转化菌的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC),以鉴定PBP1a的活性;SDS-PAGE和Western blot分析重组PBP1a蛋白的表达。结果 pbp1a基因扩增产物可见约330 bp的特异条带,大小与预期一致,测序表明重组质粒全长360 bp,无碱基的缺失、插入等突变;青霉素对转化菌的MIC从8μg/ml下降为2μg/ml;表达的重组PBP1a蛋白相对分子质量约为11 000,可与抗S.pneumoniae青霉素敏感株兔血清特异性结合。结论成功构建了S.pneumoniae pbp1a基因重组原核表达质粒,其能在S.pneumoniae中表达有活性的PBP1a蛋白,为进一步研究PBPs在细菌耐药变异中的作用提供了实验材料,也为进一步探讨消除细菌耐药性变异的措施奠定了基础。

肺炎链球菌基因PBP1a变异:172 SSN→SSV(Asn172Val)

目的:通过对台州地区β-内酰胺类抗生素耐药的肺炎链球菌青霉素结合蛋白基因的研究,分析肺炎链球菌的耐药机制。方法:收集2009年-2010年浙江台州地区63例肺炎链球菌临床株,进行培养、鉴定及药敏试验,并对耐药菌株行青霉素结合蛋白PBPs基因的PCR扩增和氨基酸序列分析。结果:研究结果显示PBP1a基因的变异位点除了以往报道的KTG保守序列之后变异为Thr574Ala,Ser575Thr,Gln57Gly,Phe577Tyr,和STMK保守区的Thr371Ala,本研究中发现172位氨基酸变异SSN→SSV。并且该菌株成高水平耐药。结论:新的氨基酸变异可能进一步降低了S.pneumoniae对β-内酰胺类抗生素的亲和力。

青霉素结合蛋白PBP1a的克隆表达和对肺炎链球菌耐药性的影响

目的克隆并表达肺炎链球菌青霉素结合蛋白PBP1a,探讨其对青霉素耐药的影响。方法化学合成肺炎链球菌含STMK区的pbp1a基因片段,PCR扩增后进行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将扩增的pbp1a基因连接pUC19载体,构建重组质粒pUC19-pbp1a,转化DH5α,PCR扩增后进行1.5%琼脂糖电泳分析和DNA测序鉴定。将pUC19-pbp1a转化对青霉素敏感、中度敏感和耐药,并存在不同的pbp1a、pbp2b突变的肺炎链球菌,SDS-PAGE分析PBP1a的表达,并测定青霉素对转化菌的MIC。结果 pbp1a基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳为330bp,大小与预期一致。重组质粒基因全长为360bp,扩增产物约330bp,测序无碱基缺失、插入等突变。重组质粒转化存在不同的pbp1a、pbp2b突变和对青霉素不同敏感性的肺炎链球菌后,大量表达约110ku蛋白,其中对青霉素敏感和中度敏感的无pbp1a突变株MIC无变化,对中度敏感菌中的pbp1a突变株MIC略有变化,对存在pbp1a突变的耐药菌株MIC显著降低(P<0.01)。结论在肺炎链球菌中成功表达了青霉素结合蛋白PBP1a,可使其对青霉素的耐药性显著降低。

高表达GFP-PBP1b融合蛋白的猪链球菌菌株的构建及PBP1b蛋白细胞定位的研究

为鉴定猪链球菌(Streptococcus suis)A型青霉素结合蛋白PBP1b在S.suis中的细胞定位,本研究经PCR扩增S.suis pbp1b基因融合位点上下游序列UP和DN、强启动子Peno基因片段及绿色荧光蛋白(GFP)gfp基因片段,再通过重叠延伸PCR扩增构建融合片段UP-Peno-GFP-DN。利用同源重组的方法将UP-Peno-GFP-DN转化含反向筛选标记的PSS-pbp1b中间菌株,经含7%蔗糖的TSAS平板筛选,挑单菌落进行PCR及测序鉴定。PCR及测序鉴定结果显示,获得的重组菌株中Peno-gfp片段替换了PSS-pbp1b中的PSS片段,表明融合强启动子Peno、GFP及PBP1b(GFP-PBP1b)的重组菌株P-GFP-pbp1b正确构建。以S.suis 05ZYH33株和本实验室前期构建的GFP-pbp1b为对照,培养P-GFP-pbp1b菌株并测定OD600nm值,绘制各菌株的生长曲线;采用western blot检测P-GFP-pbp1b菌株中GFP-PBP1b融合蛋白的表达水平,并与GFP-pbp1b菌株进行比较;利用Alexa Fluor 633-WGA染色,经超高分辨显微镜观察GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株形态及GFP-PBP1b融合蛋白在S.suis细胞中的定位。生长曲线结果显示,S.suis融合菌株GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b均正常生长;western blot结果显示,GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株均能够表达GFP-PBP1b融合蛋白,但强启动子驱动的P-GFP-pbp1b菌株中GFP-PBP1b蛋白表达量较GFP-pbp1b菌株提高了6倍(P<0.01);超高分辨显微镜观察结果显示,GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株形态均正常,GFP-pbp1b菌株中GFP荧光较弱,难以定位GFP-PBP1b,而P-GFP-pbp1b菌株中GFP荧光较强,能够明显观察到融合蛋白GFP-PBP1b定位在S.suis的细胞横隔和两极。本研究通过构建高表达GFP-PBP1b融合蛋白的P-GFP-pbp1b菌株首次观察到PBP1b在S.suis中的细胞定位,为进一步研究PBP1b在S.suis细胞壁肽聚糖合成中的作用奠定了基础。

家蚕蛹和成虫期GOBP/PBP亚家族基因簇基因定位与表达分析

昆虫的气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)在昆虫与外界环境化学信息交流过程中起着重要作用,对昆虫觅食、求偶、繁殖具有重要意义。普通气味结合蛋白/性信息素结合蛋白(general odorant binding protein/pheromone binding protein,GOBP/PBP)是鳞翅目昆虫OBP家族的一个重要单系群。为进一步明确家蚕Bombyx moriGOBP/PBP基因的结构、表达及功能,本研究利用染色体定位及半定量表达分析方法对其进行了分析。染色体定位分析显示,这些基因以基因簇的形式存在于第19染色体的nscaf3052上,基因结构相似,转录方向一致,表明这些基因可能由同源基因复制产生,并具有类似功能。对家蚕蛹和成虫不同发育阶段的雌、雄虫多种组织中进行表达分析发现,这些基因的表达在不同发育时期和不同组织间差异明显(P<0.05),相对表达量均以触角中为最高,其他非嗅觉组织中也多有表达,性别间差异不大,说明了该基因簇基因除了具有嗅觉相关的功能外,很可能具有其他尚未被发现的功能。

多重耐药鲍曼不动杆菌中ponA表达及其对碳青霉烯类抗生素诱导反应观察

目的观察多重耐药鲍曼不动杆菌(MDR-AB)中青霉素结合蛋白1a(PBP1a)基因ponA表达情况,以及ponA对碳青霉烯类抗生素诱导的反应。方法收集MDR-AB菌株19株,采用PCR法检测ponA基因表达情况并进行测序。将MDR-AB与SDF ponA基因翻译的氨基酸序列进行同源建模,用分子可视化工具软件作结构相似性分析,并与鲍曼不动杆菌抗生素敏感株(SDF)进行比较。分别用三种碳青霉烯类抗生素(亚胺培南、美罗培南、多尼培南)对MDR-AB进行诱导,qRT-PCR检测ponA表达情况并进行测序。结果19株MDR-AB均表达ponA基因,测序结果与Genbank中ATCC 17978标准菌株ponA序列显示98%同源。MDR-AB株与SDF株的ponA基因翻译氨基酸序列存在4处氨基酸变异,为第23位丝氨酸>丙氨酸、第47位丙氨酸>天冬氨酸、第110位异亮氨酸>亮氨酸、第128位谷氨酸>天冬氨酸;MDR-AB株与SDF株的ponA基因编码蛋白构象存在明显差异。亚胺培南组、美罗培南组、多尼培南组ponA基因相对表达量均低于未处理组(P均<0.05);抗生素诱导后的菌株未发现ponA基因突变。结论MDR-AB中存在ponA基因表达,其翻译氨基酸序列及编码PBP1a蛋白构象均不同于SDF;碳青霉烯类抗生素诱导可导致MDR-AB中ponA基因表达下调。

肺炎链球菌青霉素耐药相关基因研究

目的 了解我国肺炎链球菌 (Streptococcuspneumoniae,Sp)青霉素耐药相关基因的存在与突变状况。方法 设计、优化pbp1a、TEM基因PCR检测体系及扩增产物全自动DNA序列测定体系 ,对 3株分离自苏州地区患儿呼吸道的Sp(青霉素低耐株SR0 17、SR0 19;青霉素敏感株SR0 2 8,3株均苯唑青耐药 ,且SHV基因均为阴性 )进行检测 ,测得的pbp1aDNA序列与SpR6株 (青霉素敏感株 )DNA序列相比较 ;测得的TEM基因DNA序列与同院原分离的产超广谱 β内酰胺酶大肠埃希菌中检出的TEM 1DNA序列及已在GenBank登录的TEM基因序列相比较。结果 SR0 17、SR0 19、SR0 2 8之pbp1a基因均有突变 ,突变率为 2 1%、2 1%、0 .4 %。SR0 19株TEM基因阴性 ,SR0 17和SR0 2 8TEM基因阳性 ,测得DNA序列分别被证实为TEM 12 9和TEM 1,前者且是新型TEM ,作为新发现的菌种耐药基因均已登录美国国立生物信息中心GenBank ,登录号AY4 5 2 6 6 2、AY392 5 31;二者DNA序列与产超广谱 β内酰胺酶大肠埃希菌中检出的TEM高度同源 (99.7%、99.8% )。结论 我国Sp青霉素耐药可能存在产 β内酰胺酶 (获得TEM基因 )和pbp基因突变两种机制 ,TEM耐药质粒可能在不同种菌株间传播。

靶向大肠杆菌(E.coli)黏肽合成酶PBP1b的抗菌先导化合物的虚拟筛选

大肠杆菌(E.coli)是一种常见的致病菌,大肠杆菌的黏肽合成酶PBP1B对于它的细胞壁合成和存活具有至关重要的作用,是β-内酰胺类抗生素的作用靶点。但是,由于抗生素滥用等原因,目前已造成了大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素较强的耐药性。本研究针对大肠杆菌的黏肽合成酶PBP1B,通过分子对接软件DOCK6.5进行虚拟筛选,以期得到具有全新结构的高亲和力的先导化合物,用作新型抗菌药物。我们对含104万个化合物的ZINC数据库进行了虚拟筛选,以grid score进行了第1轮打分,得到分值在-30kcal/mol以下的化合物约6万个,从中挑选出打分高的600个化合物进入第2轮筛选,采用amber score进行第2轮打分,筛出分值在-20kcal/mol以下的化合物约200个。对这些化合物进行分析,最终挑选2种打分高并且结构新颖的先导化合物,并进行了有机合成。采用MH肉汤稀释法检验了先导化合物的抗菌活性,发现先导化合物对常见革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抗菌活性,并且抗菌活性比具有相似结构的磺胺嘧啶更强。因此,这2种先导化合物有望进一步开发为新型抗菌药物。