穿心莲内酯对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌关键耐药蛋白PBP2a的抑制作用

本试验旨在为探究穿心莲内酯(andrographolide, AP)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)关键耐药蛋白青霉素结合蛋白2a(penicillin binding protein 2a, PBP2a)的抑制作用。采用实时荧光定量PCR检测AP对PBP2a编码基因mecA的转录影响,通过在线软件SWISS-MODEL等对蛋白质结构进行分析,经PyMOL以及AutoDock Tools软件进行分子对接来探究AP与PBP2a结合的可能机制,运用动力学模拟来验证AP与PBP2a蛋白结合的可靠性,进一步原核表达PBP2a并制备其多克隆抗体,通过蛋白质免疫印迹检测AP作用下MRSA中PBP2a蛋白含量的变化。结果显示:64μg/mL的AP即可显著下调mecA的转录水平,AP与PBP2a蛋白的GLU170、GLU239和THR238之间可以形成稳定的氢键作用力;成功表达并纯化获得38 kDa的PBP2a蛋白转肽酶区,且制备出的多克隆抗体可以与PBP2a蛋白特异性结合;随着AP浓度的升高,PBP2a的表达量逐渐降低。总之,本研究分子模拟提示AP对PBP2a蛋白存在抑制潜力,试验结果表明AP可以通过抑制mecA的转录进而抑制PBP2a表达,从而揭示了AP使MRSA对β-内酰胺类抗生素增敏的可能机制。

基于PBP2a特异性识别的电化学免疫传感器检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的构建一种高性能的电化学免疫传感器用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)检测。方法制备MWCNT-PDA-AuNPs纳米复合物修饰至金电极表面,将MRSA标志蛋白PBP2a的抗体连接于纳米复合物表面,用牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性位点,得到一种检测MRSA的电化学免疫传感器。通过对传感器构建过程关键因素的考察确定最优条件,考察其线性范围及检出限,最后对传感器性能进行评价。结果通过CV、EIS表征分析确定传感器的成功构建;明确最优构建条件为:MWCNT-PDA∶AuNPs混合比例为1∶2,材料干燥温度为37℃,抗体孵育时间为1 h,样本孵育时间为30 min;MRSA在20 CFU/ml~2.0×10^(7)CFU/ml范围内浓度对数值与DPV峰电流值呈良好的线性关系,回归方程为I(μA)=-6.72lgC+84.26(R^(2)=0.9878),检出限为1 CFU/ml;传感器不易被杂质蛋白干扰,其对低、中、高浓度MRSA重复测定结果RSD分别为4.18%、3.59%、4.38%(n=8),保存20 d内,传感器电信号不低于初始的92%;传感器对低、中、高浓度MRSA样本检测回收率与平板计数法基本一致。结论该电化学免疫传感器构建简便,检测迅速、准确,灵敏度高,具有良好的特异性、重复性和稳定性,可以作为MRSA临床检测的备选方法。

MRSA表面标志物PBP2a的检出与苯唑西林MIC的相关性分析

目的研究MRSA表面标志物PBP2a与苯唑西林MIC的相关性。方法收集62株金黄色葡萄球菌临床分离株,通过乳胶凝集试验和全自动细菌分析仪分别检测青霉素结合蛋白2a(PBP2a)和苯唑西林MIC值。结果62株金葡中32株PBP2a检测阳性,30株PBP2a检测阴性。苯唑西林MIC≥4μg/ml31株,苯唑西林MIC≤2μg/ml31株。在苯唑西林MIC≥4μg/ml的31株MRSA中30株PBP2a检测均为阳性。结论金黄色葡萄球菌耐苯唑西林的耐药水平与PBA2a的检出有较好的相关性。

MRSA-PBP2a蛋白的体外诱导、抗体制备及鉴定

目的:探讨耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistantstaphylococcusaureus,MRSA)蛋白的体外诱导;抗MRSA PBP2a(pencillinbindingprotein2a,PBP2a)蛋白抗体的制备及效价鉴定.方法:采用NCCLS推荐的琼脂板稀释法和PCR法筛选MRSA,以β内酰胺抗生素作为诱导剂,进行体外诱导产生PBP2a蛋白.免疫家兔后产生抗MRSA PBP2a蛋白抗体,采全血分离血清,用改良双向免疫扩散法进行抗体滴度测定.结果:11株临床分离的金葡菌采用二种方法均检测出2株MRSA,SDS PAGE和Westernblot结果均显示从MRSA菌株中均能诱导出了PBP2a蛋白;免疫后均能产生较高的效价抗体,分别为1∶32和1∶64.结论:成功诱导出产生耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a蛋白菌株,并制备获得PBP2a蛋白,以及制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a蛋白抗体,为研究MRSA PBP2a蛋白活性、MRSA的免疫治疗和MRSA快速鉴定方法学的建立奠定基础.

MRSA-PBP2a单克隆抗体乳胶凝集检测法的建立

【目的】应用抗PBP2a单克隆抗体,以化学交联法致敏羧化聚苯乙烯乳胶,建立快速检测MRSA-PBP2a的乳胶凝集法。【方法】以辛酸-硫酸铵法纯化PBP2a单克隆抗体,将纯化后单克隆抗体和羧化乳胶经碳化二亚胺(EDC)共价偶联,并对偶联条件(偶联抗体浓度、乳胶浓度、偶联时间和偶联缓冲液)进行探索和优化,建立检测PBP2a的乳胶凝集法。【结果】140mg/L的抗体浓度与15g/L的羧化聚苯乙烯乳胶,在pH 5.8缓冲液中偶联8h后有较好的凝集效果和偶联效率,所建立的乳胶凝集法敏感性和特异性良好。【结论】初步建立了检测PBP2a的胶乳凝集法,为研制MRSA快速鉴定试剂盒奠定了良好的基础。

以PBP2a为靶点应用生物传感器技术筛选拮抗MRSA中药

目的应用生物传感器技术从传统抗炎中药中筛选具有拮抗细菌PBP2a活性的中药并进行活性物质含量的排序。方法将可溶性PBP2 a包被于生物传感器的生物素化样品池以建立靶点,测定115种中药水煎液去鞣质后与PBP2a的亲和力;选择亲和力较高的25种药物水提液和醇提液与定量PBP2a(50ng.ml-1)37℃混合孵育30min,再测定其与PBP2a的亲和力,以评价中药里活性物质的含量。结果115种中药中,毛冬青、金荞麦、雷公藤等25种中药与PBP2a具有较高亲和力(大于100RU);黄药子、五倍子、半枝莲、山豆根、黄连、草果、核桃根等7种中药中与PBP2 a特异性结合的活性物质含量较高。结论应用生物传感器跟踪技术筛选具有结合PBP2a作用的中药具有可行性,筛选出的7种中药均含有非鞣质类能与PBP2 a发生特异性结合作用的活性物质,该7种中药能不同程度抑制MRSA的生长。

MRSA-PBP2a转肽酶区的原核表达及鉴定

为了对编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)青霉素结合蛋白2a(PBP2a)的转肽酶区(TPase)原核表达并进行Western blot鉴定。通过PCR方法由MRSA基因组中扩增转肽酶区基因片段,并构建pGEX-6p-1-TPase重组质粒,经酶切鉴定、测序正确后,转化BL-21,用IPTG进行诱导表达,并对表达的蛋白进行Western blot鉴定。结果表明,构建的pGEX-6p-1-TPase原核表达载体可表达PBP2a的转肽酶区蛋白,为其进一步的研究和应用奠定了基础。

PBP2a的分子生物学特性及其与MRSA固有耐药的相关研究

甲氧西林耐药金葡菌(Methicillin Resistant Staphyloloccus Aureus,MRSA)是院内感染的重要致病菌之一,其致病性与甲氧西林敏感金葡菌(MetLicillinSensitiveS taphylococcus Aureus,MSSA)相似。主要引起化脓性感染,但几乎对包括甲氧西林在内的所有抗生素耐药,目前只有万古霉素和利福平敏感。自60年代Jevons首次报道MRSA以来,至80年代MRSA感染遍及全球,最高占金葡菌感染的53％。国内开展的研究较晚,主要集中在MRSA的药敏试验、分型、分布方面的研究。因此进一步研究其耐药机制,为合理使用抗生素或开发新的抗生素提供理论依据。

PBP2a的分子生物学特性及其临床应用研究进展

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是医院感染的重要病原菌之一,对常用的包括甲氧西林在内的多种抗生素广泛耐药,其主要耐药机制是mecA基因编码低亲和力的青霉素结合蛋白2a(PBP2a)蛋白所致。现就PBP2a的分子生物学特性及其在临床诊断和防治等临床应用方面的研究进展作一综述。

以可溶性PBP2a为靶点筛选拮抗MRSA中药的实验研究

目的以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)临床分离株青霉素结合蛋白2a(PBP2a)的可溶性片段为靶点,利用生物传感器筛选能够拮抗MRSA的中药。方法从临床上分离鉴定出MRSA,利用基因重组技术体外诱导表达PBP2a25～668位氨基酸,并对表达的可溶性蛋白进行鉴定及生物学功能分析;然后将PBP2a包被于羧甲基葡聚糖样品池上,利用生物传感器筛选能够拮抗MRSA的中药。结果成功诱导表达出可溶性目的蛋白PBP2a,相对分子质量为74×103,且具有一定的转肽酶及β-内酰胺酶活性;利用生物传感器筛选出10种能够拮抗MRSA的中药,其中黄芩、黄连、夏枯草3种中药抗MRSA作用较强。结论以MRSA临床分离株中可溶性PBP2a为靶点,利用生物传感器成功筛选出了能够拮抗MRSA的中药。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a相互作用蛋白的筛选

目的通过建立细菌双杂交技术,筛选MRSA中与PBP2a相互作用的蛋白。方法利用PCR扩增,获得PBP2a蛋白转肽酶活性区(TPase)的编码基因,插入pRBR构建成诱饵质粒pBR-PBP2a。提取MRSA N315株基因组DNA,经Sau3AⅠ部分酶切后连接到pRAC质粒的BamHⅠ位点,获得基因组DNA表达文库;将文库质粒转化入含诱饵质粒pBR-PBP2a的报告菌株KS1,利用细菌双杂交技术进行筛选,获得与诱饵质粒编码的融合蛋白相互作用的猎物,对猎物中编码序列进行DNA测序和生物信息学分析,确定与PBP2a发生相互作用的蛋白质或多肽。结果成功构建了pBR-PBP2a诱饵质粒,可表达PBP2a TPase与大肠埃希菌RNA聚合酶α亚单位N端序列的融合蛋白。所构建的MRSA N315株基因组文库覆盖率达9倍,满足文库筛选的需要。将文库转化含诱饵质粒和报告基因的KS1宿主菌,利用细菌双杂交技术经3次筛选,共获得9个猎物克隆,其报告基因的活性均升高2倍以上,对9个猎物质粒进行了测序,信息学分析表明它们均来自于MRSA N315株基因组,插入片段最长者648 bp,最短者334 bp,9个插入片段中含14个编码基因,其中10个功能未知,1个编码二氢吡啶二羧酸合酶、1个编码二氢吡啶二羧酸还原酶,2个编码染色体解离稳定(SMC)蛋白。9个克隆中介导与PBP2a相互作用的多肽由14～46个氨基酸组成。结论利用细菌双杂交技术从MRSA基因组文库中成功筛选到与PBP2a相互作用的多肽。

不同免疫方案制备鼠抗PBP2a多克隆抗体的比较

目的制备针对青霉素结合蛋白(PBP2a)的抗血清,比较不同免疫方案的免疫效果。方法以基因工程重组PBP2a转肽酶区蛋白作为免疫原,采用多种注射途径(足垫、腹腔、足垫+腹腔、足垫+皮下)免疫BALB/C小鼠,ELISA和Western-blot法检测所制备的抗血清效价和特异性。结果足垫快速免疫组、腹腔免疫组、足垫和腹腔免疫组、足垫加皮下免疫组的效价依次为1∶12800、1∶25600、1∶51200、1∶102400,Western-blot显示所制备的抗血清能有效识别原核表达及耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)临床分离株中的PBP2a。结论重组PBP2a蛋白免疫BALB/c小鼠能有效刺激特异性抗体的产生,足垫加皮下多点免疫法是一种值得推崇的免疫方案。

抗MRSA-PBP2a转肽酶区蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的： 制备和鉴定抗MRSA-PBP2a转肽酶区蛋白单克隆抗体（mAb）, 初步建立检测PBP2a的乳胶凝集方法.方法： 以基因工程重组PBP2a转肽酶区蛋白为抗原, 免疫BALB/c小鼠, 制备鼠源性mAb, 间接ELISA鉴定IgG亚类、腹水效价及亲和常数, Western blot检测mAb的特异性, 用所得mAb致敏聚苯乙烯乳胶, 建立检测PBP2a的乳胶凝集方法.结果： 筛选出2 株能稳定分泌抗PBP2a mAb的杂交瘤细胞株F1和F2, 免疫球蛋白亚类均为IgG1类; 腹水效价为0.5×10^6 ～1×10^6, 亲和力常数分别为1.57×10^8 M^-1和5.43×10^9 M^-1.Western blot显示F1、F2抗体均能有效识别重组PBP2a转肽酶区蛋白及MRSA临床分离株中的天然PBP2a, 用 mAb F2建立了乳胶凝集法, 敏感性达1 mg/L.结论： 获得2株特异性好、亲和力高、能稳定分泌抗PBP2a mAb的杂交瘤细胞株, 为研制MRSA快速鉴定试剂盒奠定了良好的基础.

PBP2a多克隆抗体制备及其乳胶凝集检测法的建立

目的制备兔抗青霉素结合蛋白2a(penicillin binding protein 2a,PBP2a)抗体,建立检测PBP2a的乳胶凝集法。方法以重组PBP2a转肽酶区蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blot法检测所制备的抗血清效价和特异性,用纯化的多抗建立乳胶凝集法。结果纯化的重组蛋白免疫家兔能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达1∶25 600,Western blot显示该抗体能有效识别原核表达及MRSA临床分离株中的PBP2a,建立了乳胶凝集法,敏感性及特异性良好。结论成功制备了抗PBP2a抗体血清,初步建立了检测PBP2a的乳胶凝集法,为有效制备高特异的单克隆抗体进而研制MRSA快速鉴定试剂盒奠定了良好的基础。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a的真核表达及其在抗体鉴定中的应用

目的利用杆状病毒表达系统表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白2a（PBP2a）。方法用EcoRI和BamHI双酶切pGEMT-meeA重组质粒DNA，回收目的基因mecA，与pFastBacl质粒连接转化入含有穿梭载体bacmid的大肠埃希菌DHl0Bac中，筛选重组穿梭载体Bacmid-mecA并转染Sf9细胞，获取完整的重组杆状病毒。用免疫荧光（IFA），Westernblot法进行蛋白鉴定。结果成功地获得含mecA基因的重组杆状病毒。杆状病毒感染Sf9细胞形态变化明显，能够表达出与PBP2a多克隆抗体相结合的蛋白。结论利用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统成功地表达了PBP2a蛋白。

耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌的检测及耐药性分析

目的:探讨不同方法检测耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)的敏感性,并对其耐药性进行分析。方法:应用PCR检测mecA基因、E-test、青霉素结合蛋白2a(PBP2a)乳胶凝集法、苯唑西林(OXA)琼脂筛选法和K-B法对临床分离的200株凝固酶阴性葡萄(CNS)球菌进行MRCNS检测,并用WHONET4软件进行耐药性分析。结果:各方法MRCNS检测阳性率分别为:OXA琼脂筛选法74%;OXAK-B法72%;E-test71%;PBP2a乳胶凝集法73.5%,mecA基因检测法70%,检测结果无显著性差异(χ2=1.5124,P>0.05)。MRCNS对青霉素(PEN)、庆大霉素(GEN)、复方磺胺(SXT)、环丙沙星(CIP)、四环素(TET)、克林霉素(CLI)、红霉素(ERY)等传统抗生素耐药率均在50%以上;甲氧西林敏感凝固酶阴性的葡萄球菌(MSCNS)除PEN、ERY耐药率为80.4%和57.1%以外,其他抗生素均小于或在50%左右,CNS中耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)达70%以上,未发现耐万古霉素(VAN)的CNS。结论:五种方法均能满足MRCNS的临床筛选,其中以乳胶凝集法最为简便、快速,临床值得推广;MRCNS对氨基甙类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、磺胺存在严重的交叉耐药现象,经验用药首选VAN,而MSCNS除VAN外,还可选用GEN、SXT、CIP、TET、CLI。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌多重耐药研究

目的了解本地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的多重耐药情况。方法收集经头孢西丁纸片扩散试验和青霉素结合蛋白2a胶乳凝集实验分离出的51株MRSA,用β-内酰胺酶实验、D试验、Kirby-Bauer法检测MRSA产β-内酰胺酶以及对红霉素、克林霉素、4种氟喹诺酮类药物(氧氟沙星、诺氟沙星、左旋氧氟沙星、加替沙星)和万古霉素耐药性。结果51株MRSA头孢西丁纸片抑菌圈直径介于6～20mm,产β-内酰胺酶率为84.3%,对红霉素、克林霉素、氟喹诺酮类、万古霉素耐药率分别为98.0%、86.3%、88.2%、0,红霉素诱导克林霉素耐药率为50.0%(3/6)。结论MRSA呈多重耐药,轻度感染可根据药敏结果选万古霉素与氟喹诺酮类?生素联合用药。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌微量凝集试验方法的建立及初步应用

为建立一种快速检测动物源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法,本研究以MRSA耐药性决定蛋白PBP2a的抗血清为检测抗体,通过对抗原浓度及反应温度等进行优化,确定最佳的反应条件后,建立了快速检测MRSA的微量凝集试验方法,并进行了敏感性、特异性、重复性试验以及药敏纸片法比较试验。其中,微量凝集试验最低检出MRSA的浓度为40亿/mL,该方法对MRSA的凝集反应具有良好的特异性,试验结果具有较好的重复性。采用该检测方法对分离自鸡、猪、家兔及小鼠的75株金黄色葡萄球菌进行检测,检出MRSA株占57.3%,经过与药敏纸片法检测进行比较,符合率为92%。该方法快速、准确、简单易行,适于临床或基层应用。

抗MRSA抗生素研究新进展

近年来一些新的抗MRSA抗生素研究陆续有报道 ,包括 β -内酰胺类 ,其中有头孢菌素类 (BMS -2 472 43、BAL914 1、RWJ -5 44 2 8、S -3 5 78、NB2 0 0 1)、新碳青霉烯类 (Cs -0 2 3、J -111,2 2 5、J -114 ,870和J -114 ,871)、甘氨四环素类 (GAR -93 6)、十七糖酐 (saccharomicinsA和B)、糖肽类 (oritavancin、dalbavancin)、肽聚糖合成的抑制剂 (katanosinB和 plusbacinA3 )、脂肽类 (达托霉素、雷莫拉宁 ) ,这些药物在以下方面有所进展 :( 1)提高抗菌活性 ;( 2 )克服产 β -内酰胺酶的耐药机制 ;( 3 )阻碍了细胞壁的形成。

四种初筛试验检测耐甲氧西林葡萄球菌的评价

目的评价四种初筛试验检测耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)的价值。方法收集临床分离金黄色葡萄球菌100株、凝固酶阴性葡萄球菌51株,分别进行头孢西丁纸片、MHA中添加4%NaCl的头孢西丁纸片、MHA中添加2%NaCl的苯唑西林纸片、苯唑西林-盐琼脂,以PBP2a胶乳凝集作为MRS检测标准,按CLSI2006版标准操作和判读结果。结果对于金黄色葡萄球菌,头孢西丁纸片、MHA中添加4%NaCl的头孢西丁纸片、MHA中添加2%NaCl的苯唑西林纸片、苯唑西林-盐琼脂检测MRS灵敏度和特异性分别为96.3%和100.0%、85.2%和100.0%、77.8%和100.0%、92.6%和94.5%,其中2株苯唑西林-盐琼脂24h未生长但延长至48h生长,48h内敏感性100.0%;对于凝固酶阴性葡萄球菌,四种方法检测MRS灵敏度和特异性分别为97.8%和80.0%、95.6%和80.0%、95.6%和80.0%、100.0%和80.0%(P>0.05)。结论四种方法均能可靠检测MRS,头孢西丁纸片和苯唑西林-盐琼脂具有较高应用价值。