乳腺癌细胞株MCF-7-PC-1-46的建立

以人前列腺癌C4-2细胞基因组DNA为模板,扩增出PC-1基因N端编码46个氨基酸残基及其上游非编码区共599bp的DNA序列,将其正向克隆到真核表达载体pIRES2中,并在脂质体介导下,转染人乳腺癌细胞MCF-7,经G418筛选获得阳性单克隆,细胞扩大培养后,进行PCR和RT-PCR分析,检测外源PC-1基因在靶细胞中的整合与转录。PCR和RT-PCR结果表明,稳定转染细胞株MCF-7-PC-1-46具有外源目的基因的整合和相应mRNA的高表达。说明成功建立了稳定表达外源PC-1基因N端46个氨基酸的人乳腺癌细胞株,为进一步研究PC-1基因的生物学功能提供了实验材料。

PC-1基因在肿瘤组织中的表达及其启动子区的克隆和活性分析

背景与目的:PC-1是在骨转移和雄激素非依赖的前列腺癌细胞株C4-2中高表达的新基因。本文拟研究PC-1基因在多种人肿瘤组织和正常组织中的表达水平,并对该基因的启动子区进行克隆及活性分析。方法:以PC-1基因特异性DNA序列为探针与10对肿瘤和正常组织的总RNA进行杂交;以C4-2细胞基因组DNA为模板,PCR扩增PC-1基因翻译起始位点上游DNA序列。PCR产物定向克隆到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic上,将重组质粒瞬时转染C4-2细胞,荧光素酶定量分析检测启动子活性。结果:多种肿瘤组织中PC-1基因的表达水平明显高于相应的正常组织中的表达;翻译起始位点上游340bp的片段没有启动子活性,而ATG前1099bp、1337bp、1579bp、1831bp和4939bp长度的片段都表现出启动子的功能活性。结论:PC-1基因在人前列腺癌以及多种肿瘤组织中被特异激活,表明该基因的功能可能和肿瘤的发生有关;研究的初步结果表明4939bp长度的启动子活性最强,在1831bp和4939bp之间可能含有转录增强子元件。

PC-1基因表达对前列腺癌细胞迁移能力的影响

背景与目的:PC-1基因在雄激素非依赖和高转移能力的前列腺癌C4-2细胞中高表达,在雄激素依赖及不转移的前列腺癌LNCaP细胞中低表达。本实验旨在研究PC-1对前列腺癌细胞迁移能力的影响。方法:构建PC-1稳定高表达的LNCaP细胞株和反义核酸调低内源性PC-1表达的C4-2细胞株。利用体外迁移系统检测PC-1表达对LNCaP和C4-2细胞迁移运动能力的影响。结果:体外迁移实验表明稳定转染提高PC-1的表达水平并未使LNCaP迁移细胞数增多(P>0.05),而反义核酸降低PC-1表达则使C4-2迁移细胞数降低(P<0.05)。PC-1蛋白水平升高不能提高LNCaP细胞迁移能力,但降低内源性PC-1表达则使C4-2细胞迁移能力明显降低。结论:PC-1可能在前列腺癌细胞侵袭过程中起一定作用。

p53负调控前列腺癌细胞中PC-1基因的表达

在前列腺癌进展中发生的PC-1基因表达失调和p53基因突变,提示这两个事件之间可能存在的联系.用依托泊苷处理前列腺癌LNCaP细胞后,PC1蛋白的表达受抑制;瞬时转染分析表明野生型p53负调控PC1启动子的转录活性;缺失突变分析将PC1基因启动子上受p53负调控的区域定位在翻译起始位点上游757bp～323bp之间.缺失PC1启动子上的雄激素受体反应元件并没有消除p53对其转录活性的抑制作用;无论p53是否存在,组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理LNCaP细胞后可以导致PC1启动子转录活性升高.因此,p53和去乙酰化酶可以独立抑制PC1启动子活性.这些研究结果表明,野生型p53负调控PC1基因启动子的转录活性,而前列腺癌进展过程中p53突变可能和PC-1基因的表达失调有关.

PC-1基因与肥胖关系的群体水平研究

目的 :研究肥胖、胰岛素抵抗与候选基因 PC- 1之间的关系及其在中国人群分布的规律。方法 :运用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性 (polymeras chain reaction- restriction fragment length polymorphism,PCR- RFL P) ,分析了 5 3例正常对照者 ,2 7例单纯肥胖者 (OB) ,33例肥胖伴高血压、高血脂症者 (OB+HL) ,35例肥胖伴高血压、高胰岛素血症者 (OB+HI)的浆细胞膜糖蛋白 (PC- 1)基因第 4外显子 12 1位谷氨酰胺 /赖氨酸多态性 (K、Q等位基因 )。结果 :Q等位基因频率在正常对照、肥胖人群、非肥胖糖尿病人群、糖尿病伴肥胖人群分别为 3%、18%、4%和 30 %。与正常对照组比较 ,OB、OB+HL、OB+HI人群的相对危险性 (RR)分别为 4.2 6 ,6 .35 ,8.6 2。与 OB组比较 ,OB+HL、OB+HI人群的 RR分别为 1.33和 1.81。结论 :PC- 1Q等位基因与肥胖、胰岛素抵抗的发生呈显著性正相关。 OB+HL、OB+HI者比 OB者具有更高的 PC- 1Q等位基因频率。它参与了部分中国人肥胖的发生。

PC-1分子在细胞内定位的深入探讨

为了寻找影响PC 1分子进入细胞核的序列 ,将该分子不同区段分别与EGFP融合表达 ,通过观察绿色荧光蛋白在细胞内的分布 ,发现PC 1分子的第 112～ 190区段是一独立的功能区 ,缺失这一区段后 ,分子的其余部分能够进入细胞核并在其中积累 ,这一区段使PC 1分子被排斥于细胞核之外 ,并在细胞质中浓缩成许多点状结构 .运用以SOS恢复系统为基础的酵母双杂交方法 ,发现PC 1分子能够定位于细胞膜上 ,通过缺失突变发现该分子的第 112～ 190区段是一独立的细胞膜定位信号序列 ,这一序列将其定位于细胞的胞膜上 .

PC-1分子转录激活功能研究

PC 1基因是在人前列腺癌细胞中克隆的新基因 ,表达水平随前列腺癌恶性程度增加而升高 ,其表达产物具有转录因子的一些特征 .为研究PC 1分子的转录激活功能 ,首先应用酵母双杂交系统将PC 1全长以及不同区段的cDNA克隆到表达载体pAS2 1中 ,然后分别转化酵母细胞株CG 194 5 .lacZ和His3报告基因激活的检测结果表明 ,该分子具有转录激活活性并将该活性定位于N端的 4 6个氨基酸区域 .此外 ,将PC 1分子不同区段的cDNA分别克隆至表达载体pZHO1中 ,将它们与报告基因质粒pTRE luc共转染哺乳动物细胞COS7和C4 2 ,Firefly荧光素酶相对活性的检测结果表明 ,该分子N端的 4

PC-1增强受体酪氨酸激酶家族成员EphA3在前列腺癌细胞中的转录

为了研究前列腺癌相关基因(prostate and colon gene 1,PC-1)对受体酪氨酸激酶家族分子EphA3表达的影响,用RT-PCR、实时PCR和Western印迹检测表达不同水平PC-1的前列腺癌细胞系LNCaP和C4-2中EphA3的表达情况.发现PC-1可诱导EphA3基因表达上调.采用荧光素酶实验检测PC-1对于EphA3启动子转录活性的影响,结果显示,PC-1对转录起始位点上游916 bp的启动子活性没有影响,而可增强转录起始位点上游2011 bp启动子的活性.对EphA3启动子-916 bp～-2 011 bp区域进行生物信息学分析,结果显示,此区域包含HSF、NF-1、Nkx-2、SP1和GATA-1等多种转录因子结合位点.实验结果表明,PC-1可通过影响EphA3启动子诱导EphA3基因高表达,其调控区域位于转录起始位点上游-2 011 bp至-916 bp之间,提示PC-1可能通过影响一些结合于此区域的转录因子来影响EphA3启动子的转录活性.

小鼠PC-1蛋白兔多克隆抗体的制备及初步应用

目的 :获得小鼠PC 1蛋白的兔多克隆抗体 ,检测其在小鼠器官中的表达谱。方法 :以纯化后的小鼠PC 1蛋白及其N端 45个氨基酸与GST的融合蛋白 (GST MPC 1、GST MPC 1 45 )为抗原 ,制备了它们的兔多克隆抗体。进一步应用饱和硫酸铵沉淀法、DEAE5 2和ProteinA亲和层析法对这两个抗体进行了纯化 ,Westernblot检测了PC 1蛋白在昆明白小鼠七个组织中的表达情况。结果 :两个兔多克隆血清的效价分别为 1∶2 0 0 0 0和 1∶2 0 0 0 0 0 ,并能与人工合成的人PC 1蛋白N端的 46个氨基酸发生良好的交叉反应。PC 1蛋白在结肠中有表达 ,在肾中有微弱表达 ,而在心、肺、肝、胃、脾中没有表达。结论 :获得小鼠PC 1蛋白的兔多克隆抗体 ,PC 1蛋白在结肠中有表达 ,在肾中有微弱表达 ,而在心、肺、肝、胃。

PC-1基因K121Q多态性对妊娠期糖尿病患者胰岛素抵抗的影响

目的:探讨PC-1基因K121Q多态性与妊娠期糖尿病(GDM)胰岛素抵抗(IR)的关系。方法:运用PCR-RFLP技术分析PC-1基因多态性,应用放射免疫法测量孕妇空腹胰岛素,分析GDM妇女和正常妊娠妇女两组Q、K等位基因和KQ、KK基因型与胰岛素抵抗指数(IR)之间的关系。结果:GDM组KQ基因型频率和Q等位基因频率高于正常妊娠组(分别为P<0.01和P<0.05),GDM组KQ基因型孕妇的IR高于KK基因型孕妇(P<0.05)。结论:PC-1基因与妊娠期糖尿病IR密切相关,可能参与GDM的发病机制。

青岛地区糖尿病肾病患者PC-1基因K121Q和ACE基因DI多态性的研究

目的探讨浆细胞膜糖蛋白（PC-1）基因4号外显子K121Q多态性及血管紧张素转换酶（ACE）基因与2型糖尿病肾病的相关性分析，寻找与糖尿病发病相关的致病基因。方法用多聚酶链反应（PCR）结合限制性酶切技术检测青岛地区50例2型糖尿病患者和48例正常人的PC-1基因扣ACE基因的多态性分布情况。结果正常对照组中PC-1基因KK基因型38例（79．2％），KQ基因型10例（20．8％），QQ基因型0例（0．00％），K，Q等住基因频率分别为89．6％和10．4％；糖尿病患者中KK基因型41例（82％），KQ基因型9例（18％），QQ基因型0例（0．00％），K，Q等位基因频率分别为91％和9％，2组人群的基因型和等位基因频率差异无统计学显著性意义（P〉0．05）。正常对照组、糖尿病组、糖尿病肾病组之间ACE基因型构成、等位基因频率以及DD型与非DD型构成均无显著性差异。但ACE基因和PC-1基因对糖尿病肾病的发展进程存在协同作用。结论PC-1基因4号外显子K121Q多态性与2型糖尿病及2型糖尿病肾病无明显相关性，QQ基因型不是2型糖尿病及2型糖尿病肾病发病的危险因子；ACE基因DI多态性与2型糖尿病及糖尿病肾病无明显相关性，DD基因型不是2型糖尿病及糖尿病肾病发病的危险因子。

P53参与抑制PC-1基因转录的结构域分析

目的:分析P53分子参与抑制PC-1基因转录的结构域。方法:构建P53分子突变体;将前列腺癌LNCaP细胞瞬时转染野生型或突变型p53及含PC-1启动子的荧光素酶表达载体p4939,分析PC-1启动子的转录活性。结果:P53分子N端转录激活域及富含脯氨酸功能域突变体没有减弱对PC-1启动子的转录抑制作用,而特异性DNA结合域上175、273位突变体和C端339～346位氨基酸的缺失突变体都减弱了对PC-1启动子转录的抑制作用;另外P53分子第175和273位突变体在前列腺癌细胞中对野生型P53的转录抑制功能表现出显性负效应。结论:P53分子特异性DNA结合域和C端结构域参与对PC-1基因启动子的转录抑制,而P53突变体的显性负效应可能是PC-1在前列腺癌进展中表达失调的因素之一。

PC-1蛋白鼠单克隆抗体制备的改进及意义

目的为PC-1蛋白功能的研究奠定基础。方法以纯化后的PC-1蛋白及其N端46个氨基酸与GST的融合蛋白(GST-PC-1和GST-PC-1-46)为抗原,通过常规和脾内免疫相结合的方法免疫BALB/c小鼠,经鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,用直接ELISA法进行克隆化筛选,单克隆抗体的染色体分析及亚类鉴定,检测PC-1基因表达及分布。结果成功获得2株抗鼠PC-1基因单克隆抗体,抗体亚型为IgG1,PC-1在高恶性前列腺癌细胞C4-2中高表达,在低恶性前列腺癌细胞LNCaP中少量表达,与前期研究结果相符。免疫组化染色示PC-1蛋白定位于细胞质。结论PC-1蛋白鼠单克隆抗体成功制备,针对PC-1基因蛋白的单抗在前列腺癌的放射免疫显像诊断及导向治疗上有潜在应用价值;可用于PC-1蛋白功能的研究。

PC-1蛋白单克隆抗体制备和鉴定

为获得高效价PC-1蛋白的鼠单克隆抗体(mAb),用于PC-1功能的实验,采用纯化的PC-1蛋白与GST的融合蛋白(GST-PC-1)为抗原,免疫小鼠和骨髓瘤细胞进行细胞融合,用直接ELISA法进行克隆化筛选,mAb的染色体分析及亚类鉴定及初步应用。结果表明细胞融合和ELISA筛选后,获得2株抗鼠PC-1蛋白mAb,两株PC-1 mAb效价分别为1∶25600,1∶13600,抗体亚型为IgG1,Western blot证实其特异性识别PC-1蛋白。该mAb可以用于测定PC-1蛋白。

癌基因D52家族新基因PC-1在前列腺癌细胞系LNCaP和C4-2B的G_2/M期高表达

目的:检测癌基因D52家族新基因PC-1在细胞周期各时相的表达变化。方法:用1mmol/L羟基脲处理前列腺癌细胞系LNCaP和C4-2B40h,使细胞同步化于G1/S期,在药物撤除后0～16h不同时间点收获细胞,分别进行流式分析和Western blot检测。结果:流式分析和Western blot检测在LNCaP和C4-2B细胞系中得到了趋势一致的结果,即PC-1基因在G2/M期高表达。结论:PC-1基因的表达与前列腺癌细胞的细胞周期有关,表明PC-1蛋白可能在G2/M期发挥作用。

小鼠PC-1基因在大肠杆菌中的表达和纯化

利用PCR和基因重组技术构建了小鼠PC-1基因全长cDNA及其N端45个氨基酸残基的表达质粒pGEX-4T-1-mPC-1和pGEX-4T-1-mPC-1-45。经IPTG诱导后,在大肠杆菌DH5α中,GST-mPC-1和GST-mPC-1-45两个融合蛋白都获得了可溶性高表达。经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,获得了纯的GST-mPC-1和GST-mPC-1-45蛋白。

PC-1基因K121Q多态性与OSAHS相关性研究

目的:探讨浆细胞膜糖蛋白1(plasma cell membrane glycoprotein-1,PC-1)基因K121Q多态性与中国汉族人的阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS)发病关系。方法:应用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性方法,对入选上海地区420例汉族OSAHS患者和190例对照组进行PC-1基因K121Q多态性分型及研究;分析OSAHS患者K121Q多态性与其临床指标(血压、生化指标、人体测量学等)的关系和与高脂血症的危险因素之间的关系。结果:OSAHS患者和对照组PC-1基因K121Q多态性基因型及等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05);不同性别和严重程度的OSAHS患者与对照组的基因型频率分布、等位基因频率分布差异无统计学意义(P>0.05);OSAHS患者不同基因型间ApoA-1的协方差分析显示差异有统计学意义(P=0.006)。不同基因型的OSAHS患者中伴高脂血症的患者差异无统计学意义(OR=0.935,P=0.786,95%CI为0.575～1.520)。结论:PC-1基因K121Q多态性与OSAHS发病无关,与不同性别OSAHS发病及OSAHS严重程度无关。121Q等位基因不是OSAHS患者发生高脂血症的风险因素,但121Q等位基因的OSAHS患者的ApoA-1水平显著增高。

PC-1 K121Q多态性与冠心病发病年龄的关系

目的探讨PC-1 K121Q多态性与中国人冠心病发病年龄的关系,寻找一个从基因水平及时预测和评价冠心病风险的生物学指标。方法运用PCR-RFLP方法分析膜糖蛋白PC-1基因K121Q多态性,观察Q等位基因和KK基因型在正常对照组和急性冠脉综合征组中的分布,同时比较冠心病患者中121Q等位基因携带组和121K野生基因型组间的平均年龄。结果121Q等位基因携带组年龄较121K野生基因型组轻(P<0.05);急性冠脉综合征组和正常对照组Q等位基因型分别占60.53%、33.33%,两者比较,有显著性差异(P<0.05)。结论k121Q多态是冠心病的危险因素,121Q等位基因携带者容易出现早发的急性冠脉综合征。