PC-1分子在细胞内定位的深入探讨

为了寻找影响PC 1分子进入细胞核的序列 ,将该分子不同区段分别与EGFP融合表达 ,通过观察绿色荧光蛋白在细胞内的分布 ,发现PC 1分子的第 112～ 190区段是一独立的功能区 ,缺失这一区段后 ,分子的其余部分能够进入细胞核并在其中积累 ,这一区段使PC 1分子被排斥于细胞核之外 ,并在细胞质中浓缩成许多点状结构 .运用以SOS恢复系统为基础的酵母双杂交方法 ,发现PC 1分子能够定位于细胞膜上 ,通过缺失突变发现该分子的第 112～ 190区段是一独立的细胞膜定位信号序列 ,这一序列将其定位于细胞的胞膜上 .

PC-1在前列腺癌细胞系LNCaP中的定位

目的:研究PC-1分子在前列腺癌细胞系LNCaP中的亚细胞定位。方法:利用常规PCR和重叠PCR技术在pEGFP-C1-PC-1上分别扩增PC-1的不同截短体及缺失体基因,PCR产物经酶切后克隆到真核表达载体pEGFP-C1中;经测序确定构建成功的载体在LNCaP细胞中瞬时高表达,在荧光显微镜下观察这些载体表达产物在LNCaP细胞中的定位情况,并通过Western印迹验证这些载体在LNCaP细胞中的表达。结果:构建了多个用于PC-1亚细胞定位研究的、能在LNCaP细胞中表达的载体;同时,还找到了一段对PC-1定位有重要影响的氨基酸序列。结论:为进一步研究PC-1的亚细胞定位及其发挥功能的方式提供了基础。

SIRT2在小鼠1-细胞期受精卵中的表达和定位研究

目的:探讨沉默信息调节蛋白2(SIRT2)在小鼠1-细胞期受精卵的表达和定位。方法:利用qRT-PCR、Western blotting分别检测SIRT2在小鼠1-细胞期受精卵发育全过程中mRNA和蛋白表达谱;采用细胞免疫荧光法观察SIRT2和α-tubulin的共定位情况。结果:小鼠1-细胞期受精卵SIRT2 mRNA和蛋白表达变化趋势一致,均由G 1向G 2期过渡时表达水平升高;由G 2期向M期过渡时表达水平下降(P<0.05)。在G 2期向M期过渡过程中,SIRT2的定位由细胞质向细胞核转移,于M期中期进入细胞核并定位于纺锤体,在M期后期重新定位于细胞皮质。结论:SIRT2蛋白在小鼠1-细胞期受精卵中的表达呈细胞周期时相依赖性,在1-细胞期小鼠受精卵有丝分裂间期(G 1、S、G 2)中细胞质内表达增加,积累的SIRT2在某种条件下进入细胞核调节纺锤体微管动力学,在G 2/M过渡期发挥作用。

黏质沙雷氏菌磷脂酶A_(1)辅助蛋白PlaS对宿主菌细胞膜的影响及亚细胞定位

为证明黏质沙雷氏菌磷脂酶A_(1)辅助蛋白PlaS在大肠杆菌BL21(DE3)异源表达中对细胞膜有明显的破坏作用,探究了细胞膜特性的变化,并采用气相色谱-质谱联用技术鉴定了其对细胞膜脂肪酸的影响,通过激光共聚焦显微镜验证了亚细胞水平定位。结果显示:PlaS异源表达后,宿主菌内外膜通透性明显提高、细胞膜流动性与表面疏水性严重下降,表明细胞膜功能已经丧失;脂肪酸饱和程度下降,即直链饱和脂肪酸和反式单不饱和脂肪酸相对含量降低,以及顺式单不饱和脂肪酸相对含量增加、膜刚性增强、流动性减少,细胞膜组分与结构表现异常导致细胞易死亡。激光共聚焦显微镜显示,在宿主细胞膜上发现明显荧光。综上所述,PlaS属于膜蛋白,在大肠杆菌异源表达中会破坏宿主菌细胞膜的结构与功能,表现生长抑制现象,这将为进一步PlaS抑制机理的研究与其功能开发提供一定支持。

Fudenine———个新的与血糖调节相关的膜蛋白

确定 Fudenine是否为一个新的膜蛋白。方法用绿色荧光蛋白（ GFP）对 Fudenine进行体内定位，以 GFP(一种代谢稳定的蛋白 )定位于细胞质中，作为对照。将融合质粒 Fudenine- GFP瞬时转染 CBRH7919和 L- 6TG两种细胞， 48 h后荧光显微镜下观察。结果报告质粒 GFP表达产物定位于胞质中，而融合质粒产物定位于细胞膜上。结论 Fudenine是一种膜蛋白，它可能与其同源基因 prominin和 AC133抗原有相似的功能，在血糖调控和信号转导等方面发挥作用。

人内皮高表达脂多糖相关因子1蛋白亚细胞定位研究

目的 了解人内皮高表达脂多糖相关因子1（EOLA1）蛋白在内皮细胞中的亚细胞定位情况.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞株ECV304,另构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）-EOLA1融合蛋白表达质粒.用脂质体分别将空质粒pEGFP-N2和融合蛋白表达质粒EGFP-EOLA1转染入ECV304细胞.继续培养48 h,取细胞,用蛋白质印迹法鉴定EGFP及EGFP-EOLA1融合蛋白的表达;采用激光共聚焦显微镜和免疫电镜技术,观察细胞中EOLA1蛋白的亚细胞定位情况.结果 经酶切和测序鉴定证实重组质粒EGFP-EOLA1构建成功.蛋白质印迹法检测结果显示,EGFP和EGFPEOLA1融合蛋白在转染细胞中成功表达.激光共聚焦显微镜下见转染空质粒的ECV304,绿色荧光遍布整个细胞,但无细胞核聚集现象;转染融合蛋白表达质粒的ECV304,绿色荧光也呈全细胞分布,且在胞核内明显聚集.透射电镜下见转染空质粒的细胞内无免疫沉积物,转染融合蛋白表达质粒的细胞质基质中有免疫沉积物.结论 EOLA1蛋白定位在ECV304细胞核与细胞质基质中,作为信号转导因子发挥作用.