菟丝子提取物在PC12细胞株中的神经营养因子样活性

以常用的PC12细胞株为实验模型 ,考察了菟丝子提取物诱导PC12细胞分化及对相关激酶活性的影响 .发现该提取物在诱导PC12细胞分化的同时 ,可明显提高有丝分裂原激活的蛋白激酶 (MAPK)磷酸化 .MAPK激酶的特异抑制剂PD980 5 9,能够有效地抑制菟丝子提取物诱导PC12细胞中MAPK的磷酸化和突起的延伸 ,表明该提取物诱导PC12细胞分化可能与MAPK途径有关 .同时还发现 ,该提取物能一定程度地抑制去血清引起的细胞凋亡 。

复方丹参注射液对未分化型PC12细胞株的诱导作用

目的探讨复方丹参注射液CDI对未分化型PC12细胞分化细胞形成的作用。方法采用3种不同浓度的复方丹参注射液(CDI) 10μg/ml,30μg/ml,50μg/ml对未分化型PC12细胞进行体外干预处理。显微图像Olympus Cell Sens Dimension软件实时测定分化细胞突起长度,采集不同浓度丹参注射液诱导形成突起的长度数值;用免疫组织化学方法检测分化细胞神经元NSE的表达,采用蛋白质免疫印迹法检测细胞骨架构成成分微管蛋白β3,进一步检测信号通道蛋白激酶B/Akt磷酸化程度。结果按照CDI浓度由小到大,突起发生率较对照组分别增加3.5%,18.3%和24.0%(P<0.05),微管蛋白β3表达增加(P<0.05),磷酸化的蛋白激酶B/Akt水平升高(P<0.05)。结论复方丹参注射液体外可以诱导未分化型PC12细胞突起发生,在细胞诱导分化过程中发挥重要作用,其机制可能与蛋白激酶B活化调节调节有关。

氯化钴对PC12细胞的凋亡作用

目的 确定氯化钴(CoCl2 )对PC12细胞的影响。方法 构建CoCl2 诱导的PC12细胞模型,检测CoCl2 对PC12细胞的毒性作用;将Caspases的抑制基因p3 5转染PC12细胞得到可稳定表达p3 5基因的细胞株PC12 p3 5 ,检测p3 5对CoCl2 诱导的PC12细胞的作用;检测Caspases特异性多肽抑制剂Z VAD FMK对CoCl2 诱导的PC12细胞的作用。结果 分别以10 0、3 0 0、5 0 0、70 0和10 0 0 μmol LCoCl2 诱导PC12细胞2 4h或以5 0 0 μmol LCoCl2 分别诱导PC12细胞12、2 4、3 6、48和60h后,PC12细胞存活率均明显下降(P <0 0 1) ,并与CoCl2 诱导的时间和浓度呈正相关;细胞亚显微结构检测,流式细胞分析和DNA片段化结果也表明5 0 0 μmol LCoCl2 诱导PC12细胞2 4h可使PC12细胞出现明显凋亡特征。构建可稳定表达Caspase蛋白酶抑制基因p3 5的PC12细胞株,或分别加入5 0和10 0 μmol LCaspases多肽抑制剂Z VAD FMK预处理PC12细胞1h后,以5 0 0 μmol LCoCl2 诱导PC12细胞2 4h ,形态学观察结果,细胞存活率检测和流式细胞分析均表明p3 5基因和Z VAD FMK均可有效地抑制CoCl2 诱导的PC12细胞凋亡(P <0 0 1)。结论 CoCl2 可诱导PC12细胞凋亡。

大鼠野生型钾通道亚基Kir2.3基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的:克隆大鼠野生型钾通道亚基基因Kir2.3并构建真核表达载体pcDNA3-flag/Kir2.3,观察其在大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞中的表达。方法:从成年大鼠纹状体中提取总RNA,用RT-PCR方法获得大鼠野生型Kir2.3基因的全长cDNA,经限制性内切酶双酶切后,克隆至真核表达载体pcDNA3-flag质粒中。Kir2.3基因测序结果与基因库登录序列比对,序列正确的重组质粒用脂质体转染PC12细胞,Western blot和荧光显微镜观察基因表达情况。结果:Kir2.3基因测序结果与基因库登录序列比对显示完全一致。Western blot证实pcDNA3-flag/Kir2.3转染PC12细胞24 h后有Kir2.3的过表达,且至少持续72 h。结论:成功构建了大鼠野生型Kir2.3基因的真核表达载体,获得了瞬时表达大鼠野生型Kir2.3基因的PC12细胞克隆,为进一步研究Kir2.3的生物学功能以及Kir2.3在帕金森病发病机制中的作用奠定了良好的基础。

神经节苷脂调节PKC信号通路及其对PC12细胞去血清损伤的保护作用

目的研究去血清损伤中PKC信号通路的改变,同时阐明神经节苷脂对大鼠嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)细胞去血清损伤的保护作用及其作用机制。方法采用去血清损伤24h作为损伤模型,MTT测定细胞存活率,Hoechst 33258/PI观察细胞损伤后的死亡类型及坏死、凋亡的细胞数;Western blotting检测PCl2细胞在损伤后细胞浆和细胞膜PKC蛋白的变化。结果去血清损伤时间依赖性对PC12细胞有损伤,多数细胞呈凋亡征象,而神经节苷脂对去血清损伤有明显的保护作用;去血清损伤时,PKC信号通路被活化,主要表现为PC12细胞胞浆中的PKC蛋白减少,胞膜上的PKC蛋白逐渐增加,实现PKC蛋白转位;而神经节苷脂可以抑制这种转位,从而起到保护作用。结论神经节苷脂对去血清损伤有保护作用,其保护作用部分是由于神经节苷脂抑制PKC信号通路的活化。

β-淀粉样蛋白_(25-35)致伤对PC12神经元突触相关蛋白表达的影响

背景:脑内β-淀粉样蛋白的聚集可诱导神经细胞凋亡,大量神经元及突触的缺失和功能的损害尚无有效的干预手段,提高突触可塑性为治疗早期阿尔茨海默病提供重要方向。目的:筛选最佳的阿尔茨海默病模型,检测β-淀粉样蛋白25-35致伤PC12神经元的突触相关蛋白表达。方法:采用50μg/L神经生长因子诱导PC12细胞分化为神经元样细胞,以不同浓度β-淀粉样蛋白25-35致伤PC12神经元样细胞。应用CCK8法检测细胞生存率。神经颗粒素、神经调节素免疫荧光染色观察模型细胞的形态学变化,Western blot法检测神经颗粒素、CAMKⅡ、PSD-95蛋白表达水平。结果与结论:随着β-淀粉样蛋白25-35浓度增高和作用时间的延长,PC12神经元生存率呈剂量依赖性降低;可见突触长度变短、神经元萎缩、神经元彼此连接疏松;神经颗粒素、CAMKⅡ、PSD-95蛋白表达均下调。结果提示,10μmol/Lβ-淀粉样蛋白25-35、48 h是筛选早期PC12神经元阿尔茨海默病细胞模型的最佳干预浓度和时间。

雄激素及其选择性受体调节剂对PC12细胞Seladin-1表达的影响

目的 观察雄激素和AR调节剂干预对Seladin-1表达的调控作用,以初步探讨其作用机制.方法 将培养的PC12细胞分为两组：雄激素、AR激动剂组和雄激素、AR阻断剂组,两组均设空白对照组.采用Western-blot和Real-time PCR方法对PC12细胞Seladin-1的表达进行检测.结果 AR激动剂组处理后,PC12细胞Seladin-1的蛋白质与Mrna的表达水平与正常对照组比较均明显提高,差异具有统计学意义（P〈0.05,P〈0.001）.AR阻断剂组处理后,PC12细胞Seladin-1的蛋白质与mRNA的表达水平与正常对照组比较均明显降低,差异具有统计学意义（P〈0.05）.结论 雄激素和AR参与了PC12细胞Seladin-1表达的调控,雄激素的神经保护效应可能是与通过和AR结合形成激素-受体复合物,并上调seladin-1的表达有关.

积雪草乙酸乙酯提取物对Aβ_(25-35)片段所致的PC12细胞损伤模型及SAMP8小鼠脑内SOD,GSH-Px的影响

目的:研究积雪草乙酸乙酯提取物对β淀粉样蛋白25-35片段(Aβ25-35)所致的PC12细胞损伤模型及快速老化模型小鼠(SAMP8)脑内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的影响。方法:细胞以1×104个/mL密度接种,预防实验在接种24 h后同时给予含不同质量浓度的药物培养液和终浓度为10μmol·L-1的Αβ25-35溶液,治疗实验在接种24 h后给予终浓度为10μmol·L-1的Αβ25-35溶液,24 h后给予含不同质量浓度的药物培养液,作用72 h后采用MTT法检测积雪草乙酸乙酯提取物对Aβ25-35片段所造成的PC12细胞老年性痴呆(AD)损伤模型的预防和治疗作用;Hoechst 33258荧光显微镜染色法观察积雪草乙酸乙酯提取物作用Aβ25-35片段所致PC12细胞AD损伤模型的形态学变化,SAMP8)40只随机分为模型对照组、积雪草乙酸乙酯提取物高、中、低剂量组(以生药量计为40,20,10 g·kg-1)和石杉碱甲组(0.386 mg·kg-1),8只/组,连续ig给药2个月后,ELISA法测定积雪草乙酸乙酯提取物对SAMP8大脑组织SOD和GSH-Px的影响。结果:Aβ25-35片段所致的PC12细胞AD模型的预防和治疗实验中,不同浓度的积雪草乙酸乙酯提取物对Aβ25-35片段所致PC12细胞AD损伤有不同程度的保护作用;荧光显微镜观察到用药组的凋亡细胞数少于模型对照组与MTT的结果相符;ELISA结果显示除低剂量组外,其他各组的SAMP8大脑组织的SOD均高于模型对照组(P<0.05或P<0.01),中剂量组和石杉碱甲组SAMP8大脑组织的GSH-Px比模型对照组高(P<0.05或P<0.01)。结论:积雪草乙酸乙酯提取物在体外对由Aβ25-35片段所致的PC12细胞损伤有较好的保护和治疗作用,并能通过提高SAMP8脑内SOD,GSH-Px水平起到抗氧化,清除体内自由基而延缓衰老的作用。

SPD对多巴胺D3受体（D3R）和腺苷受体（A2aR）的作用关系

目的：近年来已有证据表明了DAD3受体（D3R）与腺苷受体（A2aR）参与帕金森氏症、精神分裂症和毒品成瘾性的病理过程。本实验室长期研究左旋千金藤啶碱（SPD）为代表的四氢原小檗碱同类物（THPBs）的D1激动-D2阻滞双重作用，新近又发现SPD对D3R有较强的亲和力。本文的目的是探索D3R和A2aR在不同的功能水平上是否存在着拈抗或激动的受体间相互作用，同时研究SPD对这两种受体的作用关系。方法和结果：神经嗜铬细胞瘤PC12细胞株（称为非克隆细胞株）能稳定表达内源性A2aR，通过将体外构建含D，R基因的质粒转入PC12细胞株，

酪氨酸蛋白激酶配体EphrinB2蛋白靶向miRNA表达载体构建及其沉默效率评价

目的:针对大鼠的Efnb2基因序列(目的蛋白EphrinB2),构建特异性干扰微小RNA(miRNA)及其表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR,并检测其对Efnb2基因的干扰作用。方法:根据NM001107328基因序列设计并合成4对miRNA oligo;将4对oligo退火成双链。然后用载体构建试剂盒进行重组克隆,将4对双链miRNA oligo分别插入到miRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4个miRNA表达质粒,通过脂质体2000将已经构建好的pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR干扰质粒转染至大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中,通过qPCR检测Efnb2基因表达水平的变化。结果:DNA测序分析证明Efnb2基因的miRNA载体构建正确,RT-PCR结果表明Efnb2基因的表达水平明显降低。结论:成功地构建了针对Efnb2基因的miRNA载体,转染细胞后对Efnb2基因沉默。