橙皮素通过内质网应激通路诱导人肺癌细胞PC9发生凋亡

目的探讨不同剂量橙皮素对人肺腺癌PC9细胞凋亡和内质网应激的诱导效应及相关通路蛋白水平的变化。方法用不同剂量的橙皮素处理PC9细胞,使用LDH释放试剂盒检测其细胞毒性,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测凋亡通路中Caspase-3、Caspase-9、Apaf-1、Bcl-2和细胞色素C水平的变化,同时检测内质网应激中相关蛋白CHOP、Caspase-4、Bip、p-JNK以及三大感受器蛋白p-Perk、IRE1和ATF6的水平变化。结果随着橙皮素浓度的增加,其对PC9细胞的杀伤效应逐渐增加;在橙皮素浓度不变时,随着时间的推移,杀伤效应也逐渐增加,橙皮素对PC9细胞的杀伤效应呈时间-剂量依赖。随着橙皮素浓度的增高,PC9细胞的凋亡率逐渐上升,以早期凋亡细胞为主。不同剂量的橙皮素处理PC9细胞后,线粒体途径凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9、Apaf-1和细胞色素C水平均有不同程度的增高,而Bcl-2水平则有所下降。橙皮素处理PC9细胞还可以诱导内质网应激相关蛋白CHOP、Caspase-4、Bip、p-JNK及感受器蛋白p-Perk、IRE1和c-ATF6表达水平上调。结论橙皮素对PC9细胞具有杀伤效应,同时可以诱导PC9细胞发生线粒体途径凋亡,而这种凋亡诱导效应可能与内质网应激相关。

TGF-beta1诱导人肺腺癌PC9细胞上皮-间质转化的研究

背景与目的研究表明上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)不仅参与胚胎形成与发育,而且参与肿瘤侵袭转移。此外,人转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)已被证实为肿瘤EMT的主要诱导剂。本研究旨在探讨TGF-β1诱导人肺腺癌PC9细胞发生EMT及其对PI3K/AKT信号通道的影响。方法将体外培养的PC9细胞用不同浓度TGF-β1处理48h,相差倒置显微镜下观察细胞形态学变化;Western blot和细胞免疫荧光验证EMT相关标记蛋白表达变化。同时,采用Western blot方法检测AKT和P-AKT的表达水平。结果TGF-β1可诱导PC9细胞向间质型细胞形态转化,并上调间质标记蛋白Fibronectin的表达及下调P-AKT的表达。结论TGF-β1可诱导PC9细胞发生EMT,并影响PI3K/AKT信号通道。

隐丹参酮联合顺铂作用于非小细胞肺癌PC9细胞的体外研究

目的观察隐丹参酮(CPT)联合顺铂(DDP)对非小细胞肺癌PC9细胞的抗肿瘤作用及其分子机制。方法肺癌PC9细胞分为对照组、隐丹参酮组、顺铂组及联合用药组,MTT法检测细胞增殖凋亡,免疫印迹技术、RT-PCR检测抗凋亡分子的表达、STAT3及上游调控激酶JAK2/SRC蛋白表达水平及磷酸化水平。结果隐丹参酮联合顺铂有明显抑制肺癌PC9细胞增殖作用(P<0.05),联合用药组作用于肺癌PC9细胞24h后,caspase 3和caspase 9及PARP剪切段蛋白表达明显增高,高于对照组及单药组;联合用药组Mcl-1、Bcl-2、XIAP、survivin抗凋亡蛋白表达下调(P<0.05或P<0.01),STAT3磷酸化Tyr705和ser727水平下降,其上游JAK2磷酸化水平下调,SRC蛋白及磷酸化水平变化不明显。结论隐丹参酮联合顺铂具有协同抗肺癌PC9细胞作用,其作用机制可能是通过抑制STAT3磷酸化Tyr705和ser727表达水平,进而下调Mcl-1、Bcl-2、XIAP、Survivin蛋白的表达,上调caspase 3和caspase 9及PARP剪切段蛋白表达。

白杨素通过促进氧化应激介导的AKT/mTOR通路失活诱导肺癌细胞发生自噬

目的研究白杨素(Chrysin,CHR,5,7-二羟基黄酮)通过AKT/mTOR通路在肺癌细胞中诱导自噬的机制。方法培养肺癌细胞A549及PC9并通过行细胞活力实验、克隆形成实验检测白杨素对肺癌细胞增殖能力的影响;通过行透射电镜、免疫荧光实验、蛋白质印记、活性氧实验等探究AKT/mTOR通路在肺癌细胞中诱导自噬的机制。结果1.细胞增殖实验、克隆形成实验结果表明,白杨素可以以时间浓度依赖性的方式抑制肺癌细胞增殖。2.透射电镜的结果显示,白杨素能够增加肺癌细胞中自噬小体和自噬溶酶体数量。3.免疫荧光的实验结果表明,在白杨素作用后的肺癌细胞中,检测到LC3Ⅱ的细胞内定位和丰富的LC3Ⅱ斑点,而对照组细胞没有表现出明显的荧光强度。4.一定浓度的白杨素上调了肺癌细胞中LC3Ⅱ和Beclin 1蛋白的表达,下调了P62蛋白的表达。联合使用氯喹(CQ)后,LC3Ⅱ的表达进一步升高。5.细胞增殖实验结果表明,在加入氯喹后,白杨素对肺癌细胞增殖的抑制的能力进一步增强。6.白杨素可以促进肺癌细胞活性氧(ROS)集聚,在加入N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)后,LC3Ⅱ的表达下调。7.白杨素抑制了AKT/mTOR通路相关蛋白的表达,在加入NAC后,通路相关蛋白的表达升高。结论在肺癌中,活性氧介导的AKT/mTOR通路的失活参与了白杨素诱导的自噬,自噬抑制剂可以进一步增强白杨素的抗癌效果。

藜芦提取物的体外DPPH自由基清除作用和对PC9肺癌细胞增殖的影响

目的探讨藜芦（Veratrum nigrum）提取物对DPPH自由基清除作用和对人体肺癌细胞系PC9细胞增殖的影响，比较藜芦的水提物与醇提物的作用差异。方法DPPH自由基清除法和CCK-8细胞毒性检测法。结果藜芦水提物和醇提物在10mg／ml时体外DPPH清除率分别为52．3％和42，8％。在体外培养的条件下能明显抑制PC9细胞的增殖，并且呈浓度依赖性，而水提物只在高浓度时有抑制作用。结论藜芦提取物具有DPPH自由基清除作用，并且对PC9细胞的体外增殖有明显的抑制作用。

脂联素受体AdipoR1对肺癌细胞PC9增殖和迁移的影响

目的:观察过表达或敲低人脂联素受体1(AdipoR1)对肺癌细胞PC9增殖和迁移的影响,阐明AdipoR1对肺癌的调控作用。方法:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测AdipoR1在PC9细胞及正常人支气管上皮细胞HBEC中的表达量;利用分子克隆的方法构建AdipoR1过表达和shRNA干扰载体,转染至PC9细胞中并采用RT-PCR和Western blot方法检测AdipoR1的表达情况。运用CCK8方法和划痕愈合实验检测AdipoR1激动剂AdipoRon、AdipoR1过表达及AdipoR1敲低对PC9细胞的增殖和迁移活性的影响。结果:RT-PCR结果显示AdipoR1在PC9细胞中的表达量明显降低(P <0.05)。RT-PCR和Western blot结果显示AdipoR1过表达的PC9细胞中AdipoR1 mRNA和蛋白的表达量明显高于空载体细胞(P均<0.05),AdipoR1干扰组AdipoR1表达量明显低于阴性对照细胞(P均<0.05)。CCK8和划痕愈合实验结果显示,在24 h和48 h时,与溶剂对照组相比,AdipoRon能显著降低PC9细胞的增殖和划痕愈合率,过表达AdipoR1的PC9细胞增殖和划痕愈合率明显低于空载体细胞,而AdipoR1敲低能明显促进PC9细胞的增殖和划痕愈合率(P均<0.05)。结论:AdipoR1激动剂AdipoRon或AdipoR1过表达能抑制肺癌细胞PC9的增殖和迁移活性,而AdipoR1敲低则能明显促进肺癌细胞PC9的增殖和迁移。

人LncRNA MIR31HG基因稳定转染PC9细胞系的构建及其对细胞增殖和迁移的影响

目的:检测过表达人MIR31HG基因对PC9细胞增殖和迁移的影响,阐明促癌基因MIR31HG的作用机制。方法:通过RT-PCR法扩增长链非编码RNA(LncRNA)MIR31HG全长序列,分子克隆至 pcDNA3.1 (―)真核表达载体,将pcDNA3.1-MIR31HG过表达质粒和对照质粒pcDNA3.1分别转染人肺癌PC9细胞。采用酶切鉴定法检测MIR31HG过表达载体的构建情况。通过G418药物筛选建立稳定过表达MIR31HG的PC9细胞系(PC9-pcDNA3.1-MIR31HG,稳定转染组)和对照细胞系(PC9-pcDNA3.1,空载体组)。采用RT-PCR法检测稳定转染细胞系中MIR31HG基因表达水平,采用CCK-8法和划痕愈合实验检测PC9细胞增殖活性和迁移能力。结果:琼脂糖凝胶电泳,成功扩增得到了MIR31HG的特异基因片段;MIR31HG真核表达载体经双酶切后分别产生目的基因和载体2个片段。RT-PCR法检测,稳定转染组细胞中MIR31HG mRNA表达水平明显高于空载体组(P<0.05)。CCK-8检测,在培养24、36和48 h时,稳定转染组细胞增殖活性明显高于空载体组(P<0.01)。划痕愈合实验,在培养48 h时,稳定转染组细胞划痕愈合率明显高于空载体组(P<0.05)。结论:成功构建了人LncRNA MIR31HG基因的真核过表达载体和过表达MIR31HG的稳定转染PC9细胞系,且MIR31HG过表达能够促进肺癌PC9细胞增殖和迁移。

GLI1真核表达载体的构建、鉴定及其对肺癌PC9细胞增殖的影响

目的:构建GLI1真核表达载体,探讨过表达GLI1对肺癌PC9细胞增殖的影响。方法:采用PCR法扩增GLI1基因的全长序列,克隆至pcDNA3.1真核表达载体,将重组质粒pcDNA3.1-GLI1(重组质粒组)和对照质粒pcDNA3.1(空载体组)转染肺癌PC9细胞。采用酶切鉴定法检测GLI1过表达载体的构建情况。通过G418筛选建立稳定过表达GLI1的PC9细胞和空载体对照细胞。RT-PCR法检测2组PC9细胞中GLI1 mRNA表达水平,Western blotting法检测2组PC9细胞中GLI1蛋白表达水平,CCK-8法检测2组PC9细胞增殖活性,细胞克隆形成实验检测2组PC9细胞中克隆形成数。结果:成功扩增获得GLI1的特异基因片段;构建的GLI1真核表达载体经双酶切鉴定后分别获得目的基因和载体片段。RT-PCR法检测,重组质粒组PC9细胞中GLI1 mRNA表达水平明显高于空载体组(P<0.01)。Western blotting法检测,重组质粒组PC9细胞中GLI1蛋白表达水平明显高于空载体组(P<0.05)。CCK-8法检测,培养72和96 h后,重组质粒组细胞增殖活性明显高于空载体组(P<0.01)。细胞克隆形成实验,培养10 d时,重组质粒组细胞克隆形成数明显多于空载体组(P<0.01)。结论:成功构建GLI1基因的真核过表达载体和过表达GLI1稳定转染的PC9细胞系,GLI1过表达能够促进肺癌PC9细胞的增殖能力。

青蒿素衍生物KPC-L006对肺癌PC9细胞的抗肿瘤作用

研究青蒿素衍生物KPC-L006的体外抗肺癌活性。以不同浓度KPC-L006处理正常培养的肺癌PC9细胞。采用MTS方法检测KPC-L006处理后对PC9细胞活力的影响;进行细胞划痕实验评价药物对细胞迁移的抑制作用;AnnexinV/PI实验检测细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹技术检测凋亡相关蛋白水平的变化。KPC-L006处理后,PC9细胞活力明显下降;划痕修复率降低,细胞迁移能力减弱;细胞凋亡率明显升高;促凋亡相关蛋白Caspase-3,Bax水平提高,抗凋亡蛋白Bcl-2水平降低。KPC-L006具有明显的抗肺癌活性。

生酮饮食对EGFR/KRAS基因突变型人肺腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响及其机制

目的观察生酮饮食对人肺腺癌表皮生长因子受体(EGFR)基因突变型细胞株PC9和Kirsten大鼠肉瘤病毒基因同源物(KRAS)基因突变型细胞株A549裸鼠移植瘤生长的影响,并探讨相应机制。方法将处于对数生长期的A549、PC9细胞分别接种于裸鼠右前肢皮下,制作A549、PC9细胞裸鼠移植瘤模型。于瘤体直径达到2 mm时,将每种荷瘤裸鼠分为标准饮食组(SD组)和生酮饮食组(KD组),每组6只,分别采用标准饮食和生酮饮食,连续饮食干预30 d。定期测量裸鼠体质量、血糖、血酮体、肿瘤体积,于饮食干预第30天处死裸鼠,取肿瘤组织测量瘤重并计算抑瘤率,观察裸鼠心、肝、肺、肾、脑组织的病理变化。分析酮代谢关键酶3-琥珀酰辅酶A转移酶1(OXCT1)、β-羟基丁酸脱氢酶1(BDH1)基因在A549、PC9细胞株的表达。筛选KD组与SD组的差异表达基因,并进行KEGG通路富集分析。结果第10天起两种荷瘤裸鼠KD组血酮体水平均高于SD组(P均<0.05)。与SD组相比,KD组A549细胞移植瘤体积变小、质量变轻,KD组PC9细胞移植瘤体积增大、质量增加(P均<0.05)。KD组A549、PC9细胞移植瘤的抑瘤率分别为58%、-133%。两种荷瘤裸鼠在不同干预条件下各脏器未见明显病理改变。PC9细胞中OXCT1、BDH1基因表达高于A549细胞。不同饮食干预条件下,A549、PC9细胞裸鼠移植瘤中基因表达存在明显差异,且A549和PC9细胞荷瘤裸鼠相比,其肿瘤组织中基因表达也存在差异。KD组与SD组A549细胞裸鼠移植瘤中差异表达基因主要富集在细胞周期和JAK-STAT等信号通路,而在PC9细胞裸鼠移植瘤中差异表达基因主要富集在IL-17、Relaxin、AGE-RAGE和NF-κB等肿瘤信号通路。结论生酮饮食可抑制A549细胞裸鼠移植瘤生长但可促进PC9细胞移植瘤生长,生酮饮食干预导致两种肺癌细胞裸鼠移植瘤基因表达谱和信号通路改变,其中OXCT1基因表达升高和肿瘤信号通路富集可能是生酮饮食促进PC9细胞移植瘤生长的原因。

β-细辛醚对3种肿瘤细胞增殖的抑制作用

【目的】观察β-细辛醚对A549、PC3、PC9-R 3种肿瘤细胞增殖活力、周期、凋亡及迁移的作用,为β-细辛醚应用于肿瘤治疗提供实验依据。【方法】将不同浓度的β-细辛醚分别作用于A549、PC3、PC9-R肿瘤细胞24 h、48 h及72 h后,采用CCK-8法检测各细胞光密度(D)值,计算细胞增殖活力,采用流式细胞术测定各细胞DNA周期及细胞凋亡率,采用Transwell小室检测细胞迁移。【结果】不同浓度β-细辛醚作用A549、PC3、PC9-R肿瘤细胞24 h、48 h及72 h后,与正常对照组比较,3种细胞生长均有下降趋势,呈浓度依赖性和时间依赖性,细胞周期均表现为G0/G1期细胞比例显著上升,S期细胞比例和增殖指数显著降低,细胞凋亡率显著增高,细胞迁移显著减少(均P<0.05或P<0.01)。【结论】β-细辛醚可抑制A549、PC3、PC9-R肿瘤细胞的生长,阻滞细胞从G0/G1期进入S期,抑制DNA的合成,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移。

欧前胡素通过下调c-met的表达提高肺癌CD133~＋细胞亚群对吉非替尼的敏感性

目的:研究PC9 CD133^+细胞亚群对吉非替尼的耐药性并探讨欧前胡素提高吉非替尼抗肺癌活性的机制。方法:MTT法检测PC9细胞在吉非替尼和欧前胡素处理下的细胞活力。Western blot实验检测吉非替尼和欧前胡素对PC9细胞c-met表达水平、caspases活化水平及表皮生长因子受体(EGFR)、PI3K、AKT磷酸化水平的影响。流式细胞术检测欧前胡素和吉非替尼对PC9细胞系的CD133^+细胞亚群种群比例的影响及PC9细胞在二者处理下的凋亡率。结果:PC9 CD133^+细胞亚群对吉非替尼的敏感性显著低于PC9 CD133^-细胞亚群。吉非替尼能显著抑制PC9 CD133^-细胞亚群EGFR/PI3K/AKT的活化,但对PC9 CD133^+细胞亚群该通路的影响不大。吉非替尼单独处理能提高PC9细胞系中CD133^+细胞亚群的比例,然而联用欧前胡素后PC9 CD133^+细胞亚群的种群比例显著下降。Western blot实验表明欧前胡素能显著降低PC9 CD133^+细胞亚群的c-met蛋白表达水平表明c-met是欧前胡素的治疗靶点。MTT、Western blot、流式细胞术实验结果表明在PC9 CD133^+细胞亚群中,欧前胡素通过抑制c-met的表达提高吉非替尼对PI3K/AKT的抑制作用,从而诱导PC9 CD133^+细胞亚群发生caspases活化和凋亡。结论:欧前胡素通过下调c-met的表达提高肺癌CD133^+细胞亚群对吉非替尼的敏感性,两者存在协同抗肿瘤效应。

CIK细胞联合埃克替尼对肺腺癌细胞系的体外抑制效应

目的观察细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)疗法和盐酸埃克替尼(Icotinib)对肺腺癌PC9细胞和A549细胞的体外杀伤效应。方法以PC9和A549分别为靶细胞,将实验分为4组:CIK细胞单独组、Icotinib单药组、CIK细胞+Ic-otinib联合组和空白对照组。用噻唑蓝(MTT)法检测Icotin-ib对两种靶细胞的半数抑制浓度(IC50);细胞计数(CCK8)试剂盒以及细胞凋亡检测(Annexin V-FITC)试剂盒联合流式细胞仪检测CIK细胞和Icotinib分别及联合对PC9细胞和A549细胞的生长抑制和促凋亡作用。结果①Icotinib对PC9及A549细胞作用48 h后的IC50值分别为:(0.21±0.03)、(4.79±0.74)μmol/L;②CCK8杀伤和Annexin V-FITC凋亡实验可观察:CIK细胞与Icotinib联合应用对靶细胞的体外杀伤作用均明显高于CIK细胞单独组和Icotinib单药组。靶细胞为PC9细胞时,CIK细胞+Icotinib联合组的杀伤率可达(65.85±1.44)%;靶细胞为A549细胞时,CIK细胞+Icotinib联合组的杀伤率可达(52.92±1.57)%。结论 CIK细胞疗法联合分子靶向药物在体外可有效抑制肺癌细胞的生长,分子靶向治疗和细胞免疫疗法为临床上肺癌的综合治疗提供可行性。

白藜芦醇与吉非替尼的协同抗肺癌作用及机制研究

目的探讨白藜芦醇是否能提高吉非替尼对肺癌细胞的杀伤活性并研究其机制。方法MTT法检测人非小细胞肺癌细胞系PC9细胞在低浓度吉非替尼和白藜芦醇处理下的细胞活力。Western blot实验检测低浓度吉非替尼和白藜芦醇对PC9细胞c-met表达水平,表皮生长因子受体(EGFR)、磷脂酰肌醇激酶(PI3K)、丝氨酸苏氨酸激酶(AKT)磷酸化水平及caspases活化水平。流式细胞术检测PC9细胞在低浓度吉非替尼和白藜芦醇处理下的凋亡率。结果低浓度吉非替尼联合白藜芦醇对PC9的细胞活力抑制率显著高于低浓度吉非替尼组和白藜芦醇组[(57.7±3.3)%比(12.4±1.1)%、(8.6±0.8)%,P<0.05]。白藜芦醇处理可诱导PC9细胞c-met蛋白的下调并显著增强低浓度吉非替尼对PC9细胞PI3K和AKT磷酸化水平的抑制作用。低浓度吉非替尼联合白藜芦醇组对PC9细胞活力的抑制率和凋亡诱导率显著高于低浓度吉非替尼组和低浓度吉非替尼+白藜芦醇+c-met质粒组[抑制率:(57.7±3.3)%比(12.4±1.1)%、(16.3±1.3)%,P<0.05;凋亡率:(30.9±1.8)%比(7.2±0.5)%、(10.6±0.8)%,P<0.05]。低浓度吉非替尼联合白藜芦醇组对PC9细胞caspase-9及caspase-3的活化显著强于低浓度吉非替尼组和低浓度吉非替尼+白藜芦醇+c-met质粒组。结论白藜芦醇可能通过下调c-met的表达提高肺癌细胞对吉非替尼的敏感性。

二氢青蒿素对TNF相关凋亡诱导配体抗肺癌细胞活性的影响及其机制研究

目的探讨二氢青蒿素对肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)抗肺癌活性的影响及其机制。方法将PC9人肺癌细胞按对照组、二氢青蒿素组、TRAIL组、二氢青蒿素+TRAIL组及二氢青蒿素+TRAIL+c-FLIP质粒组进行分组,MTT法检测二氢青蒿素及TRAIL对PC9细胞的杀伤活性,流式细胞术检测PC9细胞的凋亡和活性氧簇(ROS)的释放,Western blot实验检测PC9细胞c-FLIP表达、细胞色素C释放及Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的活化。结果二氢青蒿素能显著抑制PC9细胞中c-FLIP蛋白的表达。二氢青蒿素+TRAIL组PC9细胞的相对细胞活力(0.41±0.04)显著低于TRAIL组[(0.83±0.06),P<0.05]和二氢青蒿素+TRAIL+c-FLIP质粒组[(0.75±0.06),P<0.05]。二氢青蒿素+TRAIL组PC9细胞的凋亡率(35.4±2.6)%显著高于TRAIL组[(8.7±0.8)%,P<0.05]和二氢青蒿素+TRAIL+c-FLIP质粒组[(13.5±1.1)%,P<0.05]。二氢青蒿素能显著促进TRAIL诱导的ROS的产生和细胞色素C从线粒体中的释放。二氢青蒿素能显著促进TRAIL诱导的PC9细胞中Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的活化。结论二氢青蒿素通过抑制c-FLIP的表达,增强TRAIL对肺癌细胞的凋亡诱导活性。

益气祛痰解毒方通过调控FRMD6抑制非小细胞肺癌进展的作用机制研究

目的探究益气祛痰解毒方对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的抑制作用和分子调控机制。方法构建FERM结构域蛋白6(FRMD6)敲低PC9细胞株。实验分为对照组、益气祛痰解毒方组、shNC组、shFRMD6组、益气祛痰解毒方+shNC组、益气祛痰解毒方+shFRMD6组。采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测PC9细胞的FRMD6表达水平变化。应用CCK-8法检测PC9细胞增殖率。采用Annexin V-FITC/PI法检测PC9细胞凋亡情况。利用Transwell实验检测PC9细胞侵袭能力。利用Western blot检测各组FRMD6、c-Met、p-PI3K、PI3K、p-Akt和Akt蛋白的表达。结果CCK-8检测结果表明,与对照组比较,益气祛痰解毒方对PC9细胞增殖具有显著抑制效果[(55.28±2.62)%比(100.00±2.10)%,P<0.05]。qRT-PCR和Western blot结果显示,益气祛痰解毒方可上调FRMD6表达[(1.60±0.11)比(1.00±0.13),P<0.01]。同时,与shNC组比较,益气祛痰解毒方+shNC组显著抑制PC9细胞增殖[(56.25±2.62)%比(100.00±2.10)%,P<0.05]、侵袭并促进细胞凋亡。Western blot结果发现,与shNC组比较,益气祛痰解毒方+shNC组的c-Met、p-PI3K和p-Akt表达明显下调。此外,与shFRMD6组比较,益气祛痰解毒方+shFRMD6组c-Met、p-PI3K和p-Akt表达显著下调。结论益气祛痰解毒方能够抑制肺癌细胞增殖、降低侵袭能力和促进细胞凋亡,其分子机制是通过FRMD6调控c-Met/PI3K/Akt通路来实现。

丹参二萜醌通过PERK-EIF2α通路诱导肺癌PC9细胞凋亡的机制研究

目的:探讨PERK-EIF2α通路在丹参二萜醌诱导肺癌PC9细胞凋亡中的作用。方法:采用0、2.5、5.0、7.5μg/mL丹参二萜醌处理PC9细胞24h后,CCK8法、Annexin V-FITC/PI双染色法分析细胞增殖活性及凋亡情况;Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2,PERK-EIF2α通路相关关键蛋白,以及下游CHOP、ATF4蛋白表达水平;PERKsi RNA转染PC9细胞,Western blot检测PERK蛋白的转染结果,筛选出干扰效果最佳的片段。Annexin V-FITC/PI双染色法检测沉默PERK基因后丹参二萜醌对PC9细胞的凋亡情况,Western blot分析PERK-EIF2α通路相关关键蛋白的表达情况。结果:随着丹参二萜醌浓度的增加,PC9细胞增殖抑制作用增加,凋亡率显著增高(P<0.05);随着时间延长PERK、EIF2α蛋白磷酸化水平明显增加,且以8h增加最为明显(P<0.05);其下游蛋白ATF4表达量逐渐减低,CHOP逐渐增高,呈剂量依赖性。PERK蛋白干扰后研究得到与干扰前相反的结果:与空载体组比较,丹参二萜醌诱导PC9细胞凋亡被明显抑制(P<0.05);PERK、EIF2α蛋白磷酸化水平明显降低(P<0.05),ATF4表达量有所增加,CHOP有所降低。结论:丹参二萜醌可触发PC9细胞内质网应激,其诱导细胞凋亡的机制与激活PERK/EIF2α通路密切相关。

紫檀芪通过腺苷酸活化蛋白激酶抑制PC9细胞的机制

目的观察腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）通路对紫檀芪（PTE）诱导肺腺癌PC9细胞凋亡作用的影响。方法PTE组（15、30、60 μmol/L）处理后，检测细胞活性、凋亡率、线粒体膜电位（MMP）的变化；定量检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）活性，Western blot法检测AMPK通路和凋亡蛋白。此外，PTE联合AMPK特异性抑制剂（Com C）处理裸鼠荷瘤模型，观察瘤体增长速度及关键蛋白变化。结果PTE有效抑制PC9细胞活力[（56.15±7.22）%，P＝0.016]和MMP水平[（48.63±6.17）%，P＝0.013]，并增加细胞凋亡[（58.63±7.64）%，P＝0.033]和Caspase-3活性[（231.22±17.36）%，P＝0.018]，呈剂量依赖性；Western blot检测结果显示PTE上调AMPK（P＝0.036）和乙酰辅酶A羧化酶（ACC，P＝0.014）的磷酸化以及bcl-2相关X蛋白（bax，P＝0.042）的表达，抑制B淋巴细胞瘤-2基因编码蛋白（bcl-2，P＝0.010）的表达。此外，PTE有效抑制PC9裸鼠皮下瘤体增长速度，联合应用Com C则明显阻断上述抑制作用（P＝0.012）。结论PTE通过调控AMPK通路发挥抑制PC9细胞的作用，提示激活AMPK信号通路可能是治疗肺腺癌的新策略。

培美曲塞对PC9肺腺癌细胞株的放射增敏作用

目的培美曲塞是治疗非鳞癌非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的常用药物,其对表皮生长因子受体(pithelial growth factor receptor,EGFR)敏感突变的肺腺癌是否具有放射增敏作用尚未明确。本课题研究培美曲塞在体外对EGFR 19外显子突变的人肺腺癌细胞株PC9的放射增敏作用,并初步探讨其作用机制。方法以PC9细胞作为研究对象,采用MTT法检测培美曲塞的20%抑制浓度(20%inhibition concentration,IC_(20)),将PC9细胞分为对照组、单独照射组、培美曲塞单药组和培美曲塞+照射组4组;采用流式细胞术检测培美曲塞联合或不联合照射对PC9细胞的凋亡率及细胞周期的影响;克隆形成实验检测培美曲塞对PC9细胞的放射效应,计算存活分数,拟合存活曲线;蛋白质印迹法检测CDC20蛋白在各组的表达。结果 MTT结果显示,PC9细胞的增殖抑制与培美曲塞呈时间-剂量依赖性,取48h的IC_(20)(0.084μmol/L)的培美曲塞作为实验浓度。流式细胞术结果显示,培美曲塞单药组和单独照射组均可增加凋亡率,分别为(7.17±1.14)%和(10.78±1.52)%,而培美曲塞+照射组具有协同增效作用,凋亡率达(29.23±1.33)%,F=227.57,P<0.001;细胞周期结果显示,对照组G_2/M期比例为(0.79±0.63)%,培美曲塞单药组为(0.79±0.47)%,单独照射组为(18.21±0.72)%,培美曲塞+照射组为(25.09±1.04)%,提示培美曲塞使细胞阻滞在S期,与放射线联合作用后,S期细胞比例减少,G_2/M期的比例明显增多,差异有统计学意义,F=276.85,P<0.001。克隆形成实验提示,培美曲塞具有较好的放射增敏作用,其放射增敏比(sensitization enhancement ratio,SER)为1.41。培美曲塞联合照射能增加细胞周期相关蛋白CDC20的表达,F=282.12,P<0.001。结论培美曲塞可提高EGFR 19外显子突变的PC9肺腺癌细胞的放射敏感性,其机制可能与照射引起CDC20的增加致对放射敏感的G_2/M期阻滞,而照射耐受的S期比例减少有关。

阿西替尼对人肺腺癌PC9细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

目的探讨阿西替尼对人肺腺癌PC9细胞增殖、凋亡的影响及机制。方法采用不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L)阿西替尼作用于PC9细胞72 h,计算半数抑制浓度(IC50)。CCK-8法检测阿西替尼作用后PC9细胞增殖能力,平板克隆实验观察阿西替尼对PC9细胞克隆形成的影响,流式细胞术检测PC9细胞的线粒体膜电位和凋亡情况,蛋白质印迹法检测PC9细胞中剪切Caspase-3蛋白的表达。结果阿西替尼对PC9细胞的增殖有显著的抑制作用,且呈浓度依赖性,72 h IC50为10.18 μmol/L。0、1、2、4 μmol/L阿西替尼作用10 d后,PC9细胞克隆形成率分别为(100.0±3.2)%、(58.6±2.7)%、(29.3±3.3)%、(10.9±3.0)%,差异有统计学意义(F=316.922,P<0.01)。不同浓度阿西替尼作用于PC9细胞48 h后,早期细胞凋亡率和晚期细胞凋亡率均升高,差异均有统计学意义(均P<0.01)。0、4、8、16 μmol/L阿西替尼作用24 h后,PC9细胞线粒体膜电位处于较低状态的细胞比例分别为(11.9±1.9)%、(38.5±2.3)%、(56.3±2.7)%、(76.9±3.1)%,差异有统计学意义(F=234.320,P<0.01);PC9细胞剪切Caspase-3蛋白表达水平升高,相对表达量分别为1.00±0.04、1.26±0.09、1.78±0.12、2.10±0.11,差异有统计学意义(F=55.670,P<0.01)。结论阿西替尼能抑制人肺癌PC9细胞增殖,可能通过降低PC9细胞线粒体膜电位而诱导细胞凋亡。