PCNA反义寡核苷酸对人不同恶性肿瘤细胞体外增殖活性的影响

目的 :探讨增殖细胞核抗原 (PCNA)反义寡核苷酸 (ASO)对人不同恶性肿瘤细胞体外生长的影响。方法 :PCNA ASO在脂质体 (lipofectin)介导下转染膀胱癌EJ细胞、结肠癌HCT 8细胞、肺癌GLC 82细胞及恶性胶质瘤BT 32 5细胞 ,运用细胞计数、MTT、流式细胞术、克隆形成及免疫组织化学方法分析其抗瘤活性及机制。结果 :PCNA ASO对上述 4种肿瘤细胞的体外生长均有明显抑制作用 ;不同细胞敏感性差异较大 ,其中以GLC 82细胞最敏感 ,HCT 8细胞最不敏感 ;4种细胞生长均受阻于G1期。结论 :PCNA在恶性肿瘤细胞的增殖中是必需的。PCNA

PCNA反义寡核苷酸抑制食管鳞癌细胞株T.Tn体外增殖活性的实验研究

背景与目的:增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在食管鳞癌患者中的高表达提示患者的预后不良。本研究拟通过基因反义封闭技术体外抑制PCNA的表达,以达到抑制肿瘤细胞恶性增殖的目的。方法:以食管鳞癌T.Tn细胞株为研究对象,采用硫代磷酸修饰的PCNA反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide,ASODN),通过脂质体导入T.Tn细胞后,观察PCNAASODN对T.Tn细胞癌基因表达及体外增殖活性的影响。结果:相差显微镜下观察到T.Tn细胞转染ASODN后细胞体积变小,皱缩变形的细胞较对照组明显减少。MTT法测细胞增殖活性见不同浓度ASODN均能抑制T.Tn细胞的增殖,抑制作用在24h最强,0.2μmol/LASODN对细胞的抑制率为63.3%,时间延长抑制作用逐渐减弱。3H-TdR掺入实验表明ASODN能有效地抑制T.Tn细胞的DNA合成。免疫组化SABC法染色提示转染ASODN后T.Tn细胞mRNA的翻译受到抑制,PCNA蛋白表达水平明显降低。FCM检测发现G0-G1期细胞含量由对照组的53.65%增至72.34%,而G2-M和S期细胞则分别从15.51%、30.84%降到9.87%、17.79%。表明PCNAASODN转染导致PCNA促进细胞增殖的功能降低,抑制处于G0期的细胞进入S期。结论:使用人工合成的PCNAASODN可以特异性地抑制食管鳞癌T.Tn细胞株PCNA蛋白的表达,从而调控细胞周期。

PCNA反义寡核苷酸抑制人肝癌细胞体外增殖的研究

目的 观察增殖细胞核抗原 (PCNA)反义寡核苷酸对人肝癌细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。方法 MTT法、集落形成试验观察 PCNA反义寡核苷酸对人肝癌细胞的生长抑制 ,免疫组化技术检测 PCNA的蛋白表达 ,流式细胞仪分析细胞周期变化。结果 PCNA反义核酸作用后的肝癌细胞生长明显受到抑制 ,抑制效应于作用后 48h最为明显 ,并于 72 h后逐渐减弱。集落形成率明显下降。 PCNA蛋白表达明显下降。细胞周期中 S期细胞数明显减少。结论

PCNA反义寡核苷酸对小鼠LA795肺腺癌皮下移植瘤生长的影响

目的探讨增殖细胞核抗原(PCNA)反义寡核苷酸对小鼠LA795肺腺癌皮下移植瘤生长的抑制作用。方法将20只接种LA795肺腺癌细胞T739小鼠随机分成两组。①治疗组接种LA795肺腺癌细胞后24h内用PCNA反义寡核苷酸(PCNA-ASODN)原位穿刺注射进行治疗;②对照组只注射Hank's液,每周1次,连续4周。观察两组大鼠肿瘤的一般情况与生存期。4周后断颈处死小鼠,完整地取下肿瘤,测量肿瘤体积,计算其抑瘤率。结果PCNA-ASODN治疗组小鼠LA795肺腺癌皮下移植瘤生长明显受到抑制,抑瘤率为68.53%。结论PCNA-ASODN对LA795肺腺癌皮下移植瘤生长具有抑制作用,通过反义技术可抑制靶基因的表达,从而抑制LA795肺腺癌细胞的增殖生长。

联合转染tPA基因和PCNA反义寡核苷酸抑制兔自体移植动脉再狭窄研究

目的研究血管局部联合转染组织型纤溶酶原激活物(tPA)基因和增殖细胞核抗原反义寡核苷酸(PCNA-ASODN)对自体移植动脉血管再狭窄的防治作用。方法120只新西兰雄性白兔,按数字表法随机均分为4组(对照组、PCNA-ASODN组、tPA组、tPA+PCNA-ASODN组)。将同一只兔的左、右髂外动脉(各1.0cm长)对换移植,移植血管及吻合口缝线分别用pBudCE4.1/tPA和PCNA-ASODN液浸泡。于术后3、7、14、28及56d取移植血管制片,显微镜下观察内膜增生情况,计算机图像分析测量其内膜面积和移植血管狭窄率,扫描电镜观察移植血管壁血栓形成情况,并分别用RT-PCR和免疫组织化学染色法检测tPA基因的mRNA表达率与PCNA阳性细胞百分率。结果术后3、7、14和28d时,tPA组与tPA+PCNA-ASODN组的tPA基因mRNA表达率明显高于另2组(P<0.01),PCNA-ASODN组、tPA组和tPA+PCNA-ASODN组PCNA阳性细胞百分率均明显低于对照组(P<0.05,P<0.01)。tPA+PCNA-ASODN组和PCNA-ASODN组、tPA组各时相血管壁内膜增生比对照组明显减轻,内膜面积和管腔狭窄程度显著低于对照组(P<0.05,P<0.01),且tPA+PCNA-ASODN组又明显低于另2组(P<0.05)。扫描电镜观察显示,tPA组和tPA+PCNA-ASODN组血管壁只见少量血小板附着,未见血栓形成,而对照组血管壁可见大量血小板附着,且有血栓形成。结论血管局部联合转染tPA基因和PCNA-ASODN能有效抑制VSMC增殖和血栓形成,阻止内膜增生,防止移植血管狭窄。

5’-FITC标记的PCNA反义寡核苷酸在人多形性胶质母细胞瘤细胞BT325中的分布和稳定性分析

目的 观察修饰型和非修饰型PCNA反义寡核苷酸在阳离子脂质体介导下或直接转染人多形性胶质母细胞瘤细胞BT325后在细胞内的分布及其稳定性,探讨其机理。方法 将异硫氰酸荧光素(5’-FTTC)标记的18mer硫代磷酸化修饰型及未修饰型PCNA反义寡核苷酸在脂质体介导下或直接转染人多形性胶质母细胞瘤细胞BT325,应用荧光显微镜动态观察荧光在转染细胞内的时相分布。结果 修饰型反义寡核苷酸直接转染细胞30min后,荧光在胞浆内呈现离散型点状分布,6h后胞浆荧光较强但仅有极少数细胞核有荧光积聚。在脂质体介导下,荧光细胞数目明显增加,2h后几乎所有细胞核内均出现荧光,持续24h后核内荧光逐渐减弱。而未修饰型反义寡苷酸在直接转染或脂质体介导下均发现荧光在数小时后消散。结论 阳离子脂质体DOSPER不仅能促进PCNA反义寡核苷酸进入BT325细胞核,而且其与反义寡核苷酸形成的脂质体/反义寡核苷酸复合物对反义寡核苷酸有一定的保护作用;硫代磷酸化修饰能增加PCNA反义寡核苷酸在BT325中的稳定性。

PCNA反义寡核苷酸治疗裸鼠骨肉瘤的效应

目的探讨增殖细胞核抗原(PCNA)反义寡核苷酸对裸鼠骨肉瘤生长的抑制作用。方法制备BALC/C裸鼠皮下骨肉瘤模型12只,随机分为PCNA反义寡核苷酸治疗组和对照组,每组6只。接种MG-63人成骨肉瘤细胞后24 h内用PCNA反义寡核苷酸皮下注射进行治疗,对照组只注射生理盐水,每周2次,连续4周;观察各组裸鼠肿瘤的生长情况、裸鼠的一般情况与生存期。断颈处死裸鼠,游标卡尺测量肿瘤体积大小,天平称量肿瘤的重量。结果PCNA-ASODN治疗组裸鼠骨肉瘤的生长受到抑制,抑瘤率为46.53%。结论PCNA反义寡核苷酸对骨肉瘤的生长具有抑制作用,通过反义技术可抑制靶基因的表达,从而抑制骨肉瘤细胞的增殖。

ET-1mRNA反义寡核苷酸治疗模式下糖尿病大鼠生存状况及肾脏病理进展研究

目的对糖尿病肾病(DN)大鼠模型利用内皮素反义寡核苷酸(ET-1AS-ODN)技术进行干预治疗,探讨ET-1AS-ODN在糖尿病肾病(DN)早期肾功能的保护作用。方法使用64只健康的SD雄性大鼠,通过腹腔注射链尿佐菌素(STZ)以剂量为55~60 mg/kg的方法制备糖尿病模型。随后,对其中32只大鼠给予ET-1AS-ODN 6 OD/kg/wk的治疗。在治疗过程中,对大鼠的生存状况及肾功能病理进展情况进行动态观察和测量。结果经过2、4、6、8周实验动物饲养后,与生理盐水对照组相比,8周后模型组(DM)生存率极低(P<0.05),肾功能检测血肌酐(Scr)、尿肌酐、尿素氮(BUN)水平、ET-1含量显著增高。ET-1AS-ODN治疗组在8周后效果显著,能够明显降低DN大鼠的血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平,并提高肌酐清除率(Ccr),其差异有统计学意义(P<0.05)。结论经AS-ODN早期干预治疗可以有效改善糖尿病大鼠的生存状态,并对肾功能具有保护作用。

PCNA反义寡核苷酸抑制膀胱癌细胞BIU-87体外增殖的研究

目的检测脂质体介导增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）反义寡核苷酸抑制人膀胱癌细胞ＢＩＵ８７体外增殖活性效果。方法采用细胞计数及ＭＴＴ比色法评价反义寡核苷酸对ＢＩＵ８７细胞体外增殖的影响；应用免疫组化法（ＳＡＢＣ法）检测ＰＣＮＡ蛋白表达情况。结果脂质体介导ＰＣＮＡ反义寡核苷酸组与对照组比较，ＢＩＵ８７细胞增殖活性受到明显抑制（Ｐ＜０．０５），１２小时后可完全抑制ＰＣＮＡ蛋白表达，２４、３６小时后仍有极显著的抑制作用（Ｐ＜０．０１）；脂质体介导反义寡核苷酸组与单纯反义寡核苷酸组比较，前者抑制作用提高５０倍以上；脂质体介导正义寡核苷酸组、单纯脂质体组与对照组比较均无此抑制作用（Ｐ＞０．０５）。结论脂质体介导ＰＣＮＡ反义寡核苷酸可抑制人膀胱癌细胞ＢＩＵ８７体外增殖活性。应用反义技术封闭ＰＣＮＡ基因、抑制ＰＣＮＡ蛋白表达，为膀胱癌的基因治疗提供了新的思路和探索。

PCNA反义寡核苷酸抑制人膀胱癌EJ细胞增殖活性的实验研究

目的 探讨全硫代修饰型PCNA反义寡核苷酸 (ASO)对人膀胱癌EJ细胞体外增殖活性及裸鼠体内致瘤性的影响。 方法 PCNA ASO在脂质体介导下转染EJ细胞后 ,运用细胞计数、MTT法、3 H TdR掺入试验、流式细胞术 (FCM)、克隆形成率 (CF)、SABC免疫组化、建立裸鼠动物模型等方法分析其体内外抗瘤活性及机制。 结果 在脂质体介导下 ,0 4～ 2 0 μmol/LPCNA ASO对人膀胱癌EJ细胞体外生长有一定程度的抑制作用 (31 4%～ 78 6 % ) ,呈现时间及计量效应 ;DNA合成速率降低 45 7%～ 84 6 % ;克隆形成能力下降 5 4 3%～ 78 8% ;PCNA蛋白表达减少 ;S期比率显著低于对照组 ,细胞生长受阻于G0 /G1期。 结论 PCNA ASO可抑制EJ细胞体外生长 ,降低DNA合成速率 ,减少PCNA蛋白表达 ;在裸鼠体内 ,PCNA ASO具有抗瘤活性。

反义PCNA与反义bcl-2脱氧寡核苷酸抑制人视网膜色素上皮生长

目的 观察反义增生细胞核抗原 (PCNA)和反义 bcl-2脱氧寡核苷酸对培养的人视网膜色素上皮细胞 (RPE)生长的作用 .方法 用 DNA合成仪合成有 1 8个核苷酸的反义PCNA和 1 5个核苷酸的反义 bcl- 2脱氧寡核苷酸片段 ,以不同浓度加入 RPE培养液 ,培养 2～ 4d,用 SABC法检测细胞PCNA和 bcl- 2的表达 ,用 MTT法及流式细胞仪测定细胞抑制率 .结果 6 .2 5～ 1 0 0μm ol· L- 1 的反义 PCNA对 RPE的抑制率为 8.3%～ 38.4% ,呈剂量依赖性 ,并抑制细胞 PCNA的表达 .反义 bcl- 2未显示抑制作用 .结论 反义 PCNA脱氧寡核苷酸可抑制近 40 %的 RPE生长 。

5'-FITC标记的PCNA反义寡核苷酸在人膀胱癌细胞BIU-87中的分布及稳定性分析

目的观察硫代修饰型及天然型PCNA反义寡核苷酸在脂质体介导下或直接转染人膀胱癌细胞BIU-87后在细胞内的分布及其稳定性。方法将异疏氰酸荧光素（5＇－FITC）标记的18mer硫代磷酸化修饰型及未修饰型PCNA反义寡核苷酸在脂质体介导下或直接转染人膀胱癌细胞BIU－87，应用荧光显微镜观察转染细胞从细胞内的时相分布。结果修饰型反义核酸直接转染细胞后30分钟，少数细胞胞浆荧光呈离散型、点状分布，4小时后有少数细胞胞核有强荧光聚积。在脂质体介导下，荧光细胞数目明显增加，4小时后绝大多数细胞迅速积聚于细胞核，4～8小时后，细胞核内荧光强度进一步增强，12小时后细胞荧光减弱甚至消失。而非修饰型反义核酸在直接转染或脂质体介导下均发现荧光在3小时后消失。结论脂质体增加PCNA修饰型反义寡核苷酸与膀胱癌细胞BIU－87结合的数量，同时使其在细胞核内分布聚积明显；PCNA反义寡核苷酸硫代修饰具有更好的稳定性。

反义寡核苷酸阻遏血管平滑肌细胞c-myc,PCNA基因的表达

目的：利用反义寡核着酸阻遏血管平滑肌细胞（VSMC）c-myC，PCNA基因表达，为移植血管再狭窄的基因治疗提供理论依据．方法：人工合成正义、反义及错配反义c-myc，PCNA基因片断，并转人体外培养的VSMC中，运用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）测定细胞中相应基因表达的情况．结果：反义寡核苦酸能有效抑制VSMC中c-myc，PC-NA基因的表达，而正义和错配反义寡核着酸没有此效应．结论：反义寡核着酸能阻遏VSMC中相应基因的表达．

可溶性支架转反义PCNA寡核苷酸预防静脉移植物再狭窄

目的 确定可溶性支架转反义 PCNA是否具有抑制静脉移植物内膜增殖的效果。方法 2 5只健康纯种新西兰大耳白兔随机分为对照组 ,支架组 ,正义组 ,反义组 ,错配组。将颈外静脉移植于同侧颈总动脉后用可溶性支架将反义 ,正义及错配的基因片段导入静脉移植物。术后 2 8d进行表达检测。结果 (1)反义组静脉桥的内膜厚度为(4 2 .72± 3.792 )μm,显著低于对照组、支架组、正义组及错配组 (79.0 0± 1.2 2 5 )μm ,(75 .0 4± 3.2 4 2 )μm ,(74 .77±8.5 35 )μm ,(78.6 1± 7.816 )μm,P<0 .0 1。 (2 )反义组内膜与中膜比值为 0 .6 8± 0 .2 12 ,明显低于对照组、支架组、正义组及错配组 (1.32± 0 .0 6 6 ,1.35± 0 .198,1.33± 0 .2 5 8,1.39± 0 .2 0 0 ,P<0 .0 1)。结论 运用可溶性支架转反义PCNA基因可明显抑制内膜的增殖。

VEGF和PCNA反义寡核苷酸联合治疗裸鼠骨肉瘤的实验研究

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸和增殖细胞核抗原（PCNA）反义寡核苷酸单用或联用对裸鼠骨肉瘤生长的抑制作用。方法制备Balb／c裸鼠皮下骨肉瘤模型24只，随机分为4组：VEGF反义寡核苷酸（ASODN）治疗组、PCNA反义寡核苷酸治疗，组、联合治疗组和对照组，6只／组。接种MG-63人成骨肉瘤细胞后24h内分别用VEGF反义寡核苷酸或（和）PCNA反义寡核苷酸皮下注射进行治疗，对照组只注射生理盐水，2次／周，连续4周；观察各组裸鼠肿瘤的生长情况、裸鼠的一般情况与生存期。断颈处死裸鼠，游标卡尺测量肿瘤体积大小，天平称量肿瘤的重量。结果VEGF-ASODN治疗组、PCNA—ASODN治疗组和联合治疗组裸鼠骨肉瘤的生长均受到不同程度的抑制，抑瘤率分别为44．56％、46．53％和72．71％。结论VEGF和PCNA两种反义寡核苷酸均对骨肉瘤的生长具有抑制作用，两种反义寡核苷酸联合应用比单用的疗效更为显著。

可溶性支架转反义PCNA寡核苷酸预防静脉移植物再狭窄

目的 :研究可溶性支架转反义PCNA寡核苷酸是否具有抑制静脉移植物内膜增殖的效果。方法 :2 5只健康纯种新西兰大耳白兔按体重随机分对照组 ,支架组 ,正义组 ,反义组 ,错配组 ,将颈外静脉间置于同侧颈总动脉后用可溶性支架将反义 ,正义及错配的基因片段导入静脉移植物。术后 2 8d检测各组内膜、中膜的厚度。结果 :①反义组静脉桥的内膜厚度为 42 .72± 3 .792 μm ,显著低于对照组、支架组、正义组及错配组 ( 79.0 0± 1.2 2 5μm ,75.0 4± 3 .2 42 μm ,74.77± 8.53 5μm ,78.61± 7.816μm ,P <0 .0 1)。②反义组内膜与中膜比值为 0 .68± 8.70 1,明显低于对照组、支架组、正义组及错配组 ( 1.3 2± 0 .0 66,1.3 5± 0 .198,1.3 3± 0 .2 58,1.3 9± 0 .2 0 0 ,P <0 .0 1)。结论 :反义PCNA基因可明显抑制内膜的增殖 。

纤维蛋白胶外支架转染PCNA基因反义寡核苷酸预防移植静脉再狭窄

背景:前期研究成果,纤维蛋白胶不仅是一种良好的非限制性、生物可降解血管外支架,能够预防移植静脉内膜和中膜增生,而且是一种良好的药物缓释系统,能够提高血管外膜基因转染效率。目的:验证应用纤维蛋白胶外支架转染PCNA基因反义寡核苷酸预防移植静脉再狭窄的作用。方法:建立兔颈外静脉颈总动脉旁路移植模型,随机分为模型组、纤维蛋白胶支架组、纤维蛋白胶联合反义PNCA组。后两组分别给予纤维蛋白胶和纤维蛋白胶与携带PCNA反义寡核苷酸腺病毒的混合物于静脉桥外周均匀喷洒。结果与结论:移植后第28天模型组静脉移植物内膜和中膜增生明显,纤维蛋白胶外支架组静脉移植血管内膜和中膜增生程度明显减少(P<0.01),纤维蛋白胶联合反义PNCA组内膜和中膜增生程度明显少于纤维蛋白胶外支架组(P<0.05)。纤维蛋白胶联合反义PNCA组PCNA基因mRNA及蛋白表达明显减少纤维蛋白胶外支架组(P<0.05),纤维蛋白胶外支架组表达明显弱于模型组(P<0.05)。提示血管外膜反义PCNA转染可进一步抑制移植静脉管壁PCNA表达,纤维蛋白胶外支架联合反义PCNA对移植静脉内膜和中膜增生有协同抑制作用。

可溶性支架转染c-myc基因反义寡核苷酸对静脉移植物c-myc及PCNA表达的影响

目的采用可溶性支架将原癌基因c-m yc反义寡核苷酸转染静脉移植物,观察其对静脉移植物内c-m yc蛋白和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白产物表达的影响。方法50只新西兰大耳白兔建立兔颈外静脉颈总动脉旁路移植模型后随机分成5组,每组10只。对照组:无支架;组1:植入单纯可溶性支架;组2:植入正义c-m yc寡核苷酸可溶性支架;组3:植入反义c-m yc寡核苷酸可溶性支架;组4:植入不匹配c-m yc寡核苷酸可溶性支架。于静脉移植后7d、28d和90d取出静脉移植物,采用免疫组织化学方法检测其c-m yc蛋白和PCNA蛋白的表达。结果对照组、组1、组2、组4静脉移植术后7d、28d、90d时静脉移植物内膜和中膜内可见大量c-m yc蛋白和PCNA蛋白表达阳性的细胞,与同时间点组3比较差别均有统计学意义(P<0.01)。28d、90d时5组静脉移植物内c-m yc蛋白的表达与同组7d时比较明显增强(P<0.01)。结论可溶性支架转染c-m yc反义寡核苷酸可显著抑制静脉移植物内c-m yc蛋白和PCNA蛋白的表达。

反义寡核苷酸的作用机制及其在运动系统中的研究进展

反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASOs)是一类新型的小分子基因靶向药物,可与目的mRNA结合,ASOs以其与目标序列互补的碱基配对方式,对基因进行靶向调控。随着基因测序技术和分子合成技术的不断发展,ASOs在运动系统中的研究和应用进一步深入。本文阐述了ASOs在基因沉默和表达调控中的作用机制,以及其在基因治疗方面的应用前景。此外,还介绍了ASOs在运动系统疾病中的研究进展和应用情况,并分析此类药物目前所面临的问题,旨在深化医务人员对ASOs的认识,并为其在生物医学研究和临床中的推广应用提供有益参考。