基于主成分分析的多重定量PCR荧光串扰校正

聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学常用的检测手段,主要用于对生物的DNA或RNA进行检测。由于荧光光谱重叠和滤光片过滤带宽限制,检测时所获得的荧光数据通常会包含荧光通道之间的串扰,串扰的存在使PCR结果分析变得复杂,并可能影响最终的检测结果。选择合适的光学元件,并确定通道间的补偿矩阵,可以降低甚至消除荧光串扰。目前荧光补偿矩阵大多通过迭代计算获得,还没有一种简单的方法可以从混合的多通道荧光数据中找到荧光补偿矩阵。为了快速获得荧光补偿矩阵,减小计算量,采用主成分分析法(PCA)中确定主成分的方式,基于搭建的测试平台进行单一染料实验,获得染料的荧光信号在各个检测通道的分布情况,计算得到荧光补偿矩阵。通过分析补偿矩阵,发现对于搭建的硬件系统,Cy5染料对Cy5.5通道串扰较大,串扰比例为8.76%,同时Cy5.5染料对Cy5通道串扰影响也相对较大,比例约为6.2%;其次是ROX染料对HEX通道串扰,比例约为2.68%;HEX染料对FAM通道串扰,比例约为1.58%;FAM染料对HEX通道串扰相对较小,比例约为0.25%,其余通道无明显串扰,与荧光光谱反映的结果一致。采用得到的荧光补偿矩阵对单一染料实验得到的原始荧光数据进行处理,有效去除了非目标通道的荧光串扰,实现了荧光通道数据的解耦,验证了方法的可行性。最后设计了染料颜色分辨实验,将不同浓度的多种染料进行组合测试,并采用所提出的方法将得到的数据进行荧光补偿。实验结果表明,荧光通道各自的线性相关性较高,五个荧光通道的线性相关系数r均大于0.99,该结果进一步验证了该补偿方法的有效性。

基于PCR-LFIA的非洲猪瘟病毒核酸检测方法研究

该文利用聚合酶链式反应(PCR)技术进行扩增后,以侧流免疫层析方法(LFIA)对核酸进行检测,建立了一种非洲猪瘟病毒核酸的快速检测方法。通过设计引物,构建了pUC57-ASFV-(1-1941)质粒作为阳性质控品,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒用于标记抗体建立免疫分析方法。通过优化实验条件,在质粒浓度1.6×10^(-2)~1.6×10^(8)copies/μL范围内,得到pUC57-ASFV-(1-1941)阳性质粒的检出限为1.6 copies/μL。该方法与其他猪病毒无交叉,特异性良好,可作为非洲猪瘟现场筛查的辅助方法。

基于嵌入式ARM的微流控PCR检测系统设计

为了实现微流控设备功能的集成化、提高交互系统的可操作性,提出一种基于嵌入式ARM的微流控聚合酶链式反应(PCR)控制系统及上位机软件的设计方案。系统硬件采用多个嵌入式ARM控制器与功能模块相互协调,制定可扩展的通信机制和协议,实现微流控PCR检测过程中的流路运动、温度控制、荧光信号采集等功能的集成控制。采用Qt结合SQLite数据库设计了上位机软件,利用多线程和节点映射,实现对硬件模块的协调控制以及检测信息存储。实验表明:该系统运行稳定,人机交互效果好,可操作性高,满足微流控PCR的集成功能需求。

旋转式三温区微流控PCR扩增平台的研制

微流控芯片用于聚合酶链式反应(PCR)可提高检测效率和自动化程度,但目前把核酸提取、扩增、检测功能集成到一块芯片上仍比较困难,此外,微流控芯片专用PCR仪也存在温度控制不够快速、精准的问题。作者采用空间上温度循环代替时间上温度循环的设计思路,搭建了一套旋转式三温区微流控PCR扩增平台,对大肠杆菌进行核酸提取和扩增。结果表明,旋转式三温区微流控PCR扩增平台拥有较好的热均匀性和热稳定性,平台的升降温速率分别为3.5℃/s和2.67℃/s,单次循环时间为110 s。与9700型PCR仪相比,所建平台的温度控制方案更为简单、升降温速率更高、循环时间更短。本研究结果可为实现核酸提取、扩增一体化的微流控PCR设备的研发提供参考。

蛋黄果SCoT-PCR反应体系的建立与优化

为建立和优化蛋黄果SCoT-PCR反应体系,以“仙桃1号”蛋黄果为试材,SCoT1为引物,采用L_(16)(4^(5))正交试验,对影响SCoT-PCR反应的DNA、Mg^(2+)、dNTPs、引物及Taq聚合酶等因素进行优化;并选用3份地理位置相距较远的蛋黄果种质为模板,对优化反应体系进行验证。结果表明,不同因素对蛋黄果SCoT-PCR反应体系的影响存在差异,但不显著,其中最大的影响因素是Taq聚合酶含量,其次是dNTPs浓度、模板DNA含量、引物浓度和Mg^(2+)浓度。蛋黄果SCoT-PCR最佳反应体系(20μL)为模板DNA 80 ng、3 mmol/L Mg^(2+)、0.25 mmol/L dNTPs、0.4μmol/L引物、Taq 2 U。在该体系下,3份蛋黄果种质均能稳定扩增出清晰明亮、数目丰富且稳定性高的条带,说明优化的SCoT-PCR反应体系适用于蛋黄果SCoT分子标记。

天麻PCR‑层析试纸条快速可视化检测方法的建立与评价

目的通过聚合酶链式反应(PCR)与层析试纸条结合的方法,实现天麻快速可视化真伪鉴别,并对其检测效果进行评价。方法采用一步法提取天麻及其伪品基因组DNA,应用NCBI数据库设计天麻特异性引物。采用DNA分子克隆技术制备天麻阳性质粒,作为天麻阳性对照品。建立PCR-层析试纸条法鉴定天麻真伪,摸索最优实验条件,并进行方法学评价。结果①样品DNA提取的纯度符合要求,最优的PCR反应引物浓度为1μmol/L,循环为29次。②分子克隆的天麻阳性质粒序列与天麻DNA分子标记特异性指纹区片段序列同源性为98%,可作为天麻PCR-层析试纸条法的阳性对照品。③PCR-层析试纸条法的方法学评价结果显示:天麻对照药材在试纸条上出现两个条带,伪品和阴性对照品出现1个条带,与琼脂糖凝胶电泳法结果一致,特异性良好;PCR-层析试纸条法较琼脂糖凝胶电泳法的灵敏度高100倍,天麻DNA浓度为10-1 mg/L时,试纸条仍有模糊条带;在第3、6、9、12个月采用PCR-层析试纸条法进行检测,检测结果与预期一致,稳定性良好;混合样品验证显示,PCR-层析试纸条法的最低检测限为10%,而琼脂糖凝胶电泳法的最低检测限为50%。④采用PCR-层析试纸条法对15份市售天麻样品进行检测,鉴别出3个伪品,与琼脂糖凝胶电泳法结果一致。结论所构建的PCR-层析试纸条检测方法特异性强、灵敏度高、操作简便快速,可在短时间内实现鉴定结果的可视化,检测结果准确、稳定,为道地药材天麻的真伪鉴别提供了新方法。

基于微流控技术的数字PCR的发展及其应用

作为一种新兴的扩增检测技术,基于微流控的数字聚合酶链式反应(PCR)有着高通量、高灵敏度及高耐受性等优势,因而得到了研究者的广泛关注,其相关技术也在不断的发展中。综述了基于微流控的数字PCR的研究进展,重点讨论了基于微流控的数字PCR的液滴打印技术、多层微流控芯片技术、微珠技术、聚二甲基硅氧烷(PDMS)技术等的不同实现方式。介绍了基于微流控的数字PCR在定量检测、精准分子诊断、肿瘤个性化诊断以及食品安全检测中的应用。最后,对基于微流控的数字PCR技术目前存在的不足和问题进行了阐述,并对其未来的研究方向和发展趋势进行了展望。

基于DNA条形码和特异性PCR技术鉴别蚂蟥及其常见伪品

目的:建立蚂蟥特异性PCR鉴别方法,能够快速准确地鉴别蚂蟥与其常见伪品。方法:通过分析蚂蟥与其常见伪品的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)序列,寻找蚂蟥SNP变异位点,设计特异性引物;通过对退火温度、循环次数、DNA模板量及Taq酶等关键因素的考察,确立最优反应体系及条件,并将特异性PCR方法应用到水蛭(蚂蟥)粉末中进行药材粉末的基原鉴别,同时为保证试验结果的准确性,将PCR扩增产物进行一代测序。结果:特异性PCR结果表明蚂蟥在400~600 bp有单一明亮条带,常见混伪品则无此条带,试验结果与一代测序结果一致,为蚂蟥。结论:该方法能够将蚂蟥与其常见伪品菲牛蛭、东北小水蛭、黑条、小黑条等区别,且能鉴别水蛭(蚂蟥)粉的基原,为提升中药监管力度,打击中药掺伪行为提供了强有力的技术支持。

PCR-DGGE技术分析韩式大酱与中式大酱中微生物多样性

微生物在大酱发酵过程中起到至关重要的作用,并与大酱的风味与质量密切相关,因此研究大酱中微生物的多样性有重要意义。该研究选择加工工艺不同的韩式大酱与中式大酱为对象,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术,通过PCR扩增、切胶回收、PCR测序等分析不同大酱中的微生物多样性。结果表明,大酱中的微生物由于制作工艺的不同存在明显差异。在韩式大酱中,细菌如芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、四联球菌属(Tetragenococcus)、嗜盐单胞菌属(Halomonas),真菌如根毛霉属(Rhizomucor)、青霉菌属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、外瓶霉属(Exophiala)、曲霉属(Aspergillus)等分布广泛。在中式大酱中,乳酸菌如片球菌属(Pediococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leucanostoc)、肠杆菌属(Enterobacter),酵母如鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)分布较多。与中式大酱相比,韩式大酱中的真菌种类更丰富。研究结果为进一步探讨传统发酵大酱品质提供了理论依据。

PCR可视化检测技术的开发及其在猪源性检测中的应用

该文以G-四链体和硫磺素T为报告体系,建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)可视化检测方法,仅需普通基因扩增仪和蓝光灯,即可在反应后通过肉眼观测荧光亮度直接判读结果,无需开盖,避免PCR产物污染问题的发生。并以猪源性DNA为检测目标设计特异性引物,建立猪源性可视化检测方法,通过对市售的牛、羊、兔、鸡、鸭肉对比,特异性良好,检测限达到0.01 ng/μL,可在混合肉DNA样品中检出1%的猪肉,并且能成功应用到实际食品样本的检测中。反应时间可控制在1 h以内,相较常用的实时荧光PCR,该方法既缩短时间,又不需要使用更昂贵的荧光PCR仪,且无需荧光基团修饰的探针,适合在简单的条件下进行快速定性检测。

USE OF THE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) TO DETECT MONOCLONALITY OF B CELL LYMPHO-PROLIFERATIVE DISORDERS

A technique has been developed using PCR to detect monoclonality of B-lymphoproliferative disorders. DNA was extracted from the blood, tissue and paraffin embedded sections by biochemical means or boiling. Forty cases of B-non Hodgkin's lymphoma (NHL), 15 cases of T-NHL, 8 cases of chronic lymphocytic leukemia, 17 cases of reactive lymphadenopathy and 12 cases of various non-lym-phocytic tumor were examined. Monoclonality of B-lymphocytes was detected in 86-92% of cases with B-lymphoproliferative diseases, but none in T-NHL, reactive disorders and non-lymphatic tumors. This technique provides a new molecular biologic method to diagnose malignant B-lymphoproliferative dicor-ders. It may be useful in Ig gene rearrangement study, differential diagnosis and retrospective investigation of lymphoproliferative disorders.

扩展青霉菌实时定量PCR内参基因挖掘与应用

实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术因其高效且便捷的特点在基因表达检测中被广泛应用。实时定量PCR结果数据处理策略之一是使用内参基因进行基因表达数据的标准化。文章基于扩展青霉菌孢子不同生长阶段的RNA-seq数据,挖掘和注释了694个稳定表达的候选内参基因;随机挑选出Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase在内的14个基因,以4、25℃条件下PDB培养基生长6、12、24、36 h的扩展青霉菌为材料,进行实时定量PCR实验。实时定量PCR数据基于geNorm和NormFinder 2种软件的综合分析,表明Isy1、Spt5、Nucb、Hp1适合作为内参基因。以Isy1和Spt5分别作为内参基因,检测Gh30基因在4、25℃条件下扩展青霉菌生长发育过程中的基因表达,显示出一致的基因表达水平,进一步验证了挖掘得到的内参基因的可靠性。该研究为扩展青霉菌的分子生物学研究提供了优良的内参基因,同时提供了一种高效的内参基因的挖掘和鉴定方法。

一种分区温控的实时荧光PCR快速热循环系统设计

热循环系统是实时荧光聚合酶链式反应(PCR)仪的关键组成部分,决定了核酸检测效率和结果准确性.针对传统PCR检测系统的热循环耗费时间长、温度控制复杂的问题,设计了一种分区温控的实时荧光PCR热循环系统,包括热循环系统硬件电路和机械结构,通过控制试液在不同恒温区切换实现快速热循环,采用增量式比例积分微分算法控制恒温区温度,控制精度达到±0.1℃.使用Fluent建立传热模型,分析试液热延迟现象预估试液变化规律.通过搭建PCR样机进行实验验证,试液升降温速率分别为3.8和4.4℃/s,证明了所提出PCR热循环系统能有效提高检测效率.

一种犬耳痒螨PCR检测方法的建立及应用

为了能从犬、猫耳垢中对犬耳痒螨(Otodectes cynotis)进行特异性检测,基于犬耳痒螨18S-ITS1基因序列设计特异性引物,通过对退火温度等条件进行优化,建立犬耳痒螨特异性PCR检测方法。结果显示,该方法能成功从犬耳痒螨DNA样本中扩增出352 bp的特异性条带,特异性良好;其最低检测DNA浓度为0.897 fg/μL,敏感性较高。用所建立的PCR检测方法对78只犬、猫的耳垢样本进行检测,犬耳痒螨的阳性率为66.7%,高于显微镜检测结果(阳性率为62.8%);对52份经PCR方法检测的犬耳痒螨阳性样本进行种群结构分析,未发现犬耳痒螨rDNA ITS1序列的遗传变异出现地理差异和宿主特异情况。结果表明,建立的PCR方法能够应用于临床检测犬、猫耳垢样本中的犬耳痒螨,为犬、猫耳螨病的诊断提供了一种辅助方法。

亚甲基蓝介导的电化学传感界面PCR鼠伤寒沙门氏菌检测方法

文章研究一种可用于快速检测牛奶中鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的方法,通过在聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增体系中加入嵌入式氧化/还原指示剂亚甲基蓝可以实现对扩增产物的电化学检测。文中所提出的基于丝网印刷电极的电化学检测方法可在120 min内完成对鼠伤寒沙门氏菌的检测,线性范围为3×10^(1)~3×10^(7)CFU/mL,且不受牛奶基质影响。该方法快速、简便、特异性好,有望应用于食源性致病菌现场快速检测。

PCR与G-四链体联用可视化鉴别人参与西洋参

人参和西洋参作为我国常用名贵中药,其价值很高,由于它们为人参属近缘物种,因此二者在形态和化学成分方面较为相似。然而人参和西洋参的药性和药效有较大区别,二者在临床上不可混用,所以对二者进行鉴定就尤为重要。该研究基于人参与西洋参基因组DNA上的特异性snp位点,设计了5′端含有G-四链体互补序列的上下游引物,通过PCR扩增出大量含G-四链体的双链DNA,与氯高铁血红素(Hemin)结合形成具有过氧化物酶活性的DNA酶(DNAzyme),并在H_(2)O_(2)存在的情况下催化ABTS发生颜色变化。通过对PCR体系以及显色体系的优化,达到快速、简便地鉴别人参与西洋参,灵敏度可达到0.1 ng/μL。研究建立了针对人参和西洋参的PCR与G-四链体联用的可视化鉴别方法,为人参与西洋参的鉴别提供了新的途径。

序列特异引物引导的聚合酶链式反应(PCR-SSP)结合血清学在疑难血型鉴定中的应用

目的 探讨血型血清学与序列特异引物引导的聚合酶链式反应(PCR-SSP)基因分型在ABO疑难血型鉴定中的作用。方法 用血清学分析鉴定的ABO疑难血型标本80例,同时采用PCR-SSP法进行基因分型,结合两种方法学结果,确定血型及制定输血策略。结果 血清学鉴定亚型40例,其他原因引起的抗原抗体缺失或减弱正常血型40例;PCR-SSP法基因分型亚型41例(3例二者结果不一致:血清学Ael型1例,基因分型O2O2;血清学O型1例,基因分型BO1;血清学A型1例,基因分型AB),正常血型39例。结论 使用血清学结合基因分型鉴定ABO疑难血型具有重要意义。

REP-PCR及ERIC-PCR法对分离自海产品副溶血性弧菌分型分析

目的:采用细菌基因外重复回文序列扩增(REP-PCR)和肠道细菌基因间重复序列扩增(ERIC-PCR)两种方法对副溶血性弧菌2株标准株,13株实验室保存菌株和73株分离菌株共88株进行分子分型。方法:通过REP和ERIC-PCR指纹图谱扩增,利用NTsys-pc软件采用Dice系数对指纹图谱进行聚类结果分析。结果:所有供试菌株可通过此两种方法进行分型得到清晰的指纹图谱,并反映出副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样性,REP-PCR扩增出5～9条分布在609～4200bp之间的条带,可将副溶血性弧菌分为5个群12类型,分辨指数达0.93,其中tdh+株在相似系数0.86时可聚类在第Ⅰ群;ERIC-PCR扩增出5～11条分布在400～7593bp之间的条带,将副溶血性弧菌分为7个群11个类型,分辨指数为0.94,其中tdh+株在相似系数0.76时可聚类在第Ⅰ群。结论:两种方法均显现出很好的分型能力,能够很好地将环境分离tdh+菌株和标准菌株聚类在一起,其中REP-PCR较ERIC-PCR重复性更好。

应用PCR技术检测鸭疫里默氏杆菌的研究

根据已发表的鸭疫里默氏杆菌 15型CVL110 / 89株编码 4 2_kDa主要外膜蛋白的基因序列设计并合成一对引物 ,建立PCR方法 ,对 7个血清型的鸭疫里默氏杆菌纯培养菌及野外病死鸭病料组织进行检测。结果表明 ,7个血清型的鸭疫里默氏杆菌纯培养菌DNA都可扩增出 80 9bp的DNA片段 ,而对照的 2株大肠杆菌和 1株沙门氏菌纯培养物DNA扩增结果为阴性 ;在对 2 4只不同鸭场病死鸭肝、脑的检测中 ,脑的检出率为 19/ 2 4 (高于细菌分离的 13/ 2 4 ) ,肝脏的检出率为 11/ 2 4 (高于细菌分离的 8/ 2 4 )。由此可见 ,建立的PCR技术可用于鸭疫里默氏杆菌的鉴定和快速诊断 (取脑组织 )。但此方法是否对其他血清型的鸭疫里默氏杆菌也适用 ,有待于收集这些血清型的菌株进行验证。

PCR法快速检测鸭疫里氏杆菌的研究

根据Gen-Bank中25株鸭疫里氏杆菌(RA)的外膜蛋白A(OmpA)基因序列,在其高度保守区设计了一对特异性引物,成功地建立了鸭疫里氏杆菌的快速、准确PCR检测方法。RA参考菌株J04(2型)、J07(JX1型)均能扩增出671bp的特异性目的条带,而对鸭源大肠杆菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌、鸭源葡萄球菌的扩增结果均为阴性。PCR产物经EcoRI酶切鉴定得494bp和177bp两个预期条带。最低检出基因组DNA浓度为800fg。用全菌体进行PCR时,本实验室分离鉴定的60株RA均能够扩增出特异性目的条带。25份临床疑似病例的分离菌株的PCR扩增阳性率与生化鉴定率完全一致。该方法表明能从病料组织培养8h的混合菌群中快速、准确地检测到RA,可用于RA的快速诊断和流行病学调查。