猪瘟病毒PCR-ELISA检测方法的初步应用

猪瘟(classicalswinefever,CSF)是危害猪健康的重要传染病之一,具有急性、热性和高度接触性等特性,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PCR-ELISA检测方法是在PCR和ELISA基础上创新的一种新技术,其灵敏性和准确性都高于单纯的PCR检测和ELISA检测。根据GenBank中猪瘟石门株序列,设计特异性引物,分别在5'端标记生物素和地高辛,经过PCR扩增后,加入到包被有链霉亲和素的ELISA反应板上,然后通过DIG-HRP抗体进行显色反应,建立PCR-ELISA检测方法。结果表明:PCR-ELISA最低检测到1.81×10^(4)拷贝/μL,普通PCR最低检测到1.81×10^(6)拷贝/μL,因此PCR-ELISA灵敏性比普通PCR高约100倍;对27份未知样品进行检测,普通PCR检测出阳性样品15份,阳性率为55.5%,PCR-ELISA检出20份阳性样品,阴性7份,阳性率为74%,阳性检出率增加18.5%;用建立的Real-TimePCR进行验证,检测结果与PCR-ELISA一致,两者的符合度为100%;然后用PK15细胞对普通PCR未检测出的阳性样品进行病毒分离培养,通过间接免疫荧光(IFA)及普通PCR检测,结果显示该5份样品均为阳性。说明本研究所建立的PCR-ELISA方法具有灵敏、特异、准确、快速、安全等优势,可应用于CSFV的快速诊断,为CSFV的流行病学监测提供有力保障。

应用地高辛标记的PCR-ELISA技术快速检测转基因水稻

应用地高辛标记的PCR-ELISA(Dig-PCR-ELISA)技术进行转基因水稻检测研究。针对转基因水稻中普遍存在的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S 启动子(p35S)、胭脂碱合成酶(NOS)终止子(Tnos),筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因(hpt,hpt)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、抗草丁膦除草剂基因(bar),建立Dig-PCR-ELISA检测方法;能进行半定量检测,敏感性试验表明,Dig-ELISA检测比常规电泳检测可提高敏感性达1 000倍,可检测含量达0.1％的GMO样品。全过程可在24 h内完成。

PCR-ELISA检测弓形虫实验研究

目的建立快速、敏感、特异、稳定的PCR-ELISA方法,并用其检测感染动物体内的弓形虫。方法将生物素标记的PCR产物与地高辛标记的特异性探针杂交,再通过酶免显色反应测出OD值,以判断弓形虫感染情况。测定该方法的敏感性、特异性及稳定性。再分别以104、103弓形虫RH株速殖子腹腔接种小鼠,取全血、肝组织用PCR-ELISA检测小鼠感染情况。结果本实验中,PCR-ELISA方法的检测阈值为20fg弓形虫DNA,其灵敏度是电泳法的10倍,并且与人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA均无交叉反应。同一样本重复测试5次,结果经统计学检验,一致性良好(Alpha=0.72)。检测感染动物肝组织及全血标本,104、103组分别在感染后第二d、第三d即可测出阳性,两种标本的阳性检出效率无统计学差异(P>0.05)。结论PCR-ELISA是一种快速、敏感、特异、稳定的检测方法,可试用于临床弓形虫病的诊断及流行病学调查。

用地高辛标记的PCR-ELISA技术快速检测转基因鱼

取含有小鼠重金属螯合蛋白 (mMT)基因启动子及人生长激素 (hGH)基因的鱼样品 ,以Qiagene核酸纯化技术对鱼组织DNA进行纯化。常规PCR检测显示 ,mMT启动基因和hGH基因的PCR产物分别为2 4 0bp和 130bp ,与设计相符。PCR产物的核酸测序结果证实其扩增产物具特异性。地高辛 PCR(Dig PCR)标记反应显示 ,2个基因均产生 1条Dig标记的特异产物带。Dig PCR ELISA检测敏感性试验显示 ,对mMT启动子和hGH基因的检测敏感性可达 10 - 3,与常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测方法相比 ,检测敏感性可提高至 10 0～ 10 0 0倍。试验证明 ,针对mMT和hGH基因所建立的Dig PCR

PCR-ELISA检测端粒酶活性的方法及其在人体肿瘤中的应用

目的 :介绍PCR -ELISA端粒酶活性测定方法 ,并对不同组织来源肿瘤端粒酶活性检测结果进行分析。方法 :采用PCR -ELISA端粒酶活性检测方法对299例不同组织来源肿瘤端粒酶活性进行检测。结果 :本组结果显示PCR -ELISA端粒酶活性测定方法在敏感性与特异性方面与国外报道的同位素方法结果一致。在多种人类恶性肿瘤组织中可检出端粒酶活性 ,而与各种肿瘤对应的正常组织及良性病变中则多为阴性。结论 :本组结果提示PCR -ELISA法为一高敏感的半定量评价端粒酶活性的方法 。

食品中金黄色葡萄球菌PCR-ELISA检测技术建立

针对食品中金黄色葡萄球菌检测,选取金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因作为靶标,利用地高辛标记引物扩增的PCR产物与生物素标记的探针杂交,然后与ELISA平板上的链霉素杂交,通过抗地高辛抗体显色建立PCR-ELISA检测技术。应用该方法检测人工污染牛奶中金黄色葡萄球菌,同时将大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌等常见食源性致病菌作为阴性对照。结果显示,金黄色葡萄球菌的纯培养物以及人工污染金黄色葡萄球菌牛奶,金黄色葡萄球菌为阳性,其他对照菌为阴性,两者PCR-ELISA检测敏感性均为10-1CFU/m L,比普通PCR检测的敏感性（10-3CFU/m L）高100倍。因此,该研究建立的PCR-ELISA方法具有良好的特异性与敏感性,能够特异、敏感、准确地检测牛奶中的金黄色葡萄球菌,为食品中金黄色葡萄菌的快速鉴定、风险评估与有效监测提供重要技术手段。

人隐孢子虫RT-PCR-ELISA检测方法的建立

目的建立一种高度敏感和特异的人隐孢子虫的RT-PCR-ELISA检测方法。方法根据人隐孢子虫与其他隐孢子虫粘附蛋白p23基因的多重比对,设计一对引物(其中p1引物带有生物素标记)用来扩增含高变区目的片段;采用RT-PCR方法扩增目的片段,扩增产物与探针引物进行液相杂交,将杂交产物与微孔板上包被的链霉亲和素结合,再与辣根过氧化酶标记的抗地高辛抗体反应。用所建立的方法对22份临床样本进行检测,并与常规检测方法进行比较。结果所建立的RT-PCR-ELISA检测方法具有高特异性和敏感性,比常规的PCR方法灵敏度提高了100(0.08:8ng)左右。临床检测结果显示,该方法的检出率高达86%(19/22),而RT-PCR、蔗糖漂浮法和抗酸染色法的检出率仅为27%(6/22)、27%(6/22)和50%(11/22)。结论本试验成功建立了人隐孢子虫的RT-PCR-ELISA检测方法,检出率比常规检测方法高。

实时荧光PCR法与ELISA法在发热伴血小板减少综合征病例检测中的比较

目的比较实时荧光PCR法与酶联免疫吸附试验(ELISA)在发热伴血小板减少综合征病例检测中的差异。方法对143例2011年河南省发热伴血小板减少综合征监测病例的急性期血清,分别应用实时荧光PCR法和ELISA-IgM方法进行检测,结果进行统计学分析。结果 143例病例经实时荧光PCR法检测,阳性率50.35%,经ELISA-IgM法检测,阳性率为37.76%,两种方法的检测有统计学意义(P<0.05)。对于间隔时间超过1w的病例,两种检测方法无统计学意义(P>0.05)。结论实时荧光PCR法更适合于发热伴血小板减少综合征病例的早期实验室诊断,ELISA方法可对发病1w以上病例的实验室诊断。

番茄环斑病毒HC-RT-PCR-ELISA检测

番茄环斑病毒 (ToRSV)是我国对外检疫一类有害生物 ,目前国内尚无存在的报道。PCR技术是一种快速灵敏的植物病毒检测方法 ,但核酸内的聚合酶抑制物会导致漏检现象 ,而只通过凝胶电泳进行结果判定会出现假阳性 ,这两方面限制了PCR技术在对外检疫中的应用。利用共价结合在PCR管壁上的引物特异性杂交诱捕核酸粗提液中的靶标核酸 ,洗掉杂质及抑制物质 ,在同一管内作RT PCR ,凝胶电泳检测液相产物的同时对固相产物进行杂交检测 ,提高了结果的可靠性及灵敏度。利用所建立的HC RT PCR ELISA成功地从法国进口葡萄苗中检出ToRSV。

粉虱传双生病毒的TAS-ELISA及PCR快速检测

利用粉虱传双生病毒 (WTGs)多克隆抗体及单克隆抗体 ,建立了三抗体夹心 EL ISA (TAS-EL ISA)检测 WTGs的方法 ,并发现了单克隆抗体 SCR18可广泛用于我国 WTGs的检测。利用根据WTGs基因组上基因间隔区及外壳蛋白基因保守序列设计的引物 ,建立了 PCR特异检测 WTGs的方法。对田间病样的 TAS- EL ISA和 PCR检测表明 ,粉虱传双生病毒在云南省烟草、番茄和南瓜上均存在 ,2种方法的测定结果是一致的。

猪瘟RT-PCR ELISA诊断方法的建立

将RT-PCR方法和高灵敏度的地高辛检测系统相结合,先建立猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)的RT-PCR方法,用地高辛标记RT-PCR产物;再建立CSFV的PCR-ELISA方法,用生物素标记的探针在链亲和素包被的微量板孔中杂交捕获地高辛标记的PCR产物,最后进行免疫显色得出结果。试验主要对RT-PCR ELISA的各种反应条件进行了优化,确定了1mg/L的链亲和素、50μg/L生物素标记的探针、1∶3000抗地高辛的过氧化物酶、37℃杂交2h等为最适反应条件。该方法的敏感性比常规琼脂糖凝胶电泳检测高100倍以上,克服了组织样品中CSFV含量少而难以检测的困难,为猪瘟的早期诊断和分子流行病学调查提供了一条新途径。

兰州百合病毒多重PCR和ELISA检测体系的比较与应用

采用多重PCR和ELISA 2种方法分别对兰州百合中的主要病毒进行检测,以调查田间发病率,对比筛选病毒检测最优的方法.结果表明:通过多重PCR,从带有黄瓜花叶病毒、百合无症病毒和百合斑驳病毒的样品中同时扩增出3条与试验设计大小相符的特异条带.ELLSA检测表明,兰州百合病情含量随种植年限的增加而增加,3年生>2年生>1年生;通过脱毒组培苗的检测,脱毒率随培养代数的增加而增加.对2种不同病毒检测方法的结果进行卡方检测,二者的符合率在90%以上,且多重PCR检测的特异性和敏感性较高.

用RT-PCR和ELISA对暴发性急性胃肠炎事件中诺沃克样病毒检测的比较

目的 诺沃克样病毒是世界范围内急性非细菌性流行性胃肠炎的重要病原。采用RT-PCR和ELISA两种方法对广州市多起暴发性急性胃肠炎事件中病人标本进行诺沃克样病毒检测 ,了解广州市诺沃克样病毒流行情况 ,并对RT-PCR和ELISA两种检测方法进行比较。方法 用RT-PCR和ELISA对 76份腹泻病人粪便 ,2 3份肛拭子 ,12份食物进行诺沃克样病毒检测。结果 粪便通过RT-PCR检出阳性 37份 ,ELISA检出阳性 17份 ,肛拭子仅通过RT-PCR检出 1份阳性 ,食物无阳性检出。结论 这是首次我国实验室证实的由诺沃克样病毒引起的急性胃肠炎暴发。RT-PCR的阳性率大于ELISA ,且检品以粪便为好。并且我们的分离株与诺沃克原型株相应序列比较的同源性大于 90 %

PCR-ELISA检测疟原虫DNA的研究

目的：介绍一种诊断疟疾的新方法ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ。方法：根据业已报道的疟原虫ＳＳＵｒ－ＲＮＡ基因保守序列，设计并合成一对通用于恶性疟原虫和间日疟原虫的引物，其中一引物的５’端加以生物素标记。经ＰＣＲ扩增后，携带有生物素的扩增产物与先期包被于ＥＬＩＳＡ板上的亲和素结合，再经与恶性疟原虫、间日疟原虫特异、荧光素标记的寡核苷酸探针分别杂交，底物显色等步骤，使ＰＣＲ产物得以半定量地检出。结果：对于恶性疟原虫和间日疟原虫，本法检出最低原虫密度阈值分别为４和１０个原虫／μｌ血（取血２０μｌ），本法检测两种疟原虫未发现交叉反应。结论：本试验具有较高的敏感度和特异性。

梨火疫细菌实时荧光PCR和诱捕PCR-ELISA检测方法的建立

根据梨火疫细菌中独特而保守存在的质粒pEA2 9,设计了 1对引物和 3条探针 ,建立了实时荧光PCR检测方法和诱捕PCR ELISA检测方法。实时荧光PCR采用带荧光标记的核酸杂交探针 ,边扩增边检测 ,步骤简单 ,不需PCR后处理 ,可避免假阳性和交叉污染 ;诱捕PCR ELISA检测方法只需简单处理的样品就能检测 ,减少了核酸不纯出现的漏检 ,由于增加了核酸杂交探针 ,可不需凝胶电泳EB染色检测 ,不会出现假阳性问题。

空肠弯曲杆菌PCR-ELISA检测方法的建立

针对空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)旋转酶基因(gyrA gene)设计特异性引物和探针,将生物素和地高辛分别标记上游引物5′端和核酸探针3′端,并对反应条件进行优化,建立空肠弯曲杆菌PCR-ELISA检测方法。结果表明:该方法能特异的检测空肠弯曲杆菌基因组DNA,检测阈值为2 fg,敏感性是常规PCR的10倍。对模拟泄殖腔样本进行检测,检测限为50 cfu/mL。对100份临床样品进行检测,PCR和PCR-ELISA方法阳性检出率分别为60%和69%。

PCR-ELISA检测大鼠卡氏肺孢子虫DNA的研究

目的 建立卡氏肺孢子虫 (P .c )DNA的聚合酶链反应 酶联免疫吸附测定 (PCR ELISA)方法 ,并探讨其应用价值。 方法 实验组患卡氏肺孢子虫肺炎的SD大鼠和Wistar大鼠各 2 8只 ,采用PCR法扩增大鼠肺组织DNA和支气管肺泡灌洗液 (BALF)DNA ,用PCR ELISA检测其扩增产物。 2 8只患病大鼠分别制作肺组织印片及BALF涂片 ,姬姆萨 (Giemsa)染色镜检 10 0个视野中有无P .c包囊 (或滋养体 ) ,与PCR ELISA检测扩增产物结果比较。 结果 两种方法检测大鼠肺组织DNA阳性率及BALFDNA阳性率 ,结果相同 ,均分别为 96 4% (2 7/2 8)和10 0 % (2 8/2 8)。Giemsa染色镜检P .c包囊 (或滋养体 ) ,结果为阳性的大鼠 ,PCR ELISA检测扩增产物结果也均为阳性。阴性对照组 ,两种大鼠的肺组织和BALF各 10份标本 ,均有 1只大鼠阳性。 结论 PCR ELISA检测大鼠卡氏肺孢子虫DNA ,敏感性较高 ,特异性较好 ,操作简便 ,具有实用价值。

猪瘟RT-PCR ELISA诊断方法的建立及其初步应用

建立了检测CSFV的快速、敏感、特异的RT PCRELISA方法。在RT PCR过程中以地高辛标记的dUTP(DIG dUTP)标记PCR产物 ,用生物素标记的捕获探针在链亲和素包被微量板孔中杂交捕获PCR产物。该方法的敏感性较常规RT PCR方法高 10 0倍 ,可检测出 35 0 μL1∶10 0 (相当于 3.5mg)的兔脾组织悬液中的C株CSFV ,特异性强 ,避免了PCR过程中因污染导致的假阳性结果。通过对RT PCR和微量杂交系统的条件优化 ,该方法用于检测C株兔脾组织毒、细胞适应毒和野毒感染的猪组织毒样品 。

PCR-ELISA用于HFRS病人早期诊断的研究

目的 建立检测HFRS患者血清标本中HV基因的PCR -ELISA方法。方法 设计并合成互补于HVS基因片段的标记引物 ,对 98例HFRS患者血清进行RT -nestedPCR扩增 ,并用酶免方法分析扩增产物。结果 98例患者不同病日采集的血清标本的RT -nestedPCR平均检出率仅为 6 0 .2 % ,而PCR -ELISA平均检出率为 80 .6 %。结论 PCR

FQ-PCR测定HBV DNA与ELISA检测HBV-M相关性分析

目的探讨HBV DNA含量与HBsAg S/CO值之间的相关性。方法分别用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测100例乙肝患者的HBV DNA含量和乙肝两对半,并记录HBsAg S/CO值。结果100例乙肝患者HBV DNA含量对数值为(4.28±1.89),HBsAg S/CO值为(15.09±6.64),两指标间作相关性分析,r=-0.0156,P>0.05,无相关性。结论HBV DNA是判断乙肝病毒复制的较准确、较直接的抗乙肝病毒疗效观察指标,而HBsAgS/CO值的高低与疾病的严重程度及疗效无关。