新疆地区盐湖的中度嗜盐菌的16S rDNA PCR-RFLP分析

对来自新疆地区艾丁湖、艾比湖和玛那斯盐湖等盐湖的２８株中度嗜盐菌与９株相关的参比菌株， 进行了１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析，这些菌株是革兰氏阴性杆菌，能在０～２５％ＮａＣｌ中生长。在实验中， 选用４种限制性内切酶ＡｌｕＩ、ＨｉｎｆＩ、ＲｓａＩ和ＨａｅⅢ，将供试菌株的１６Ｓ ｒＤＮＡ的ＰＣＲ产物进行酶切，用３％ 的琼脂糖电泳分析酶切产物。结果表明，在７４％的相似性水平上分为３群。群Ⅰ包括新分离的菌株ＣＩ和 参比菌株死海色盐杆菌（Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ）和Ｎｅｓｔｅｒｅｎｋｏｎｉａ ｈａｌｏｂｉａ；群Ⅱ包括伸长盐单胞（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｎｇａｔａ）在内的７株参比菌株和８株新分离的菌株;群Ⅲ包括１９林新分离的菌株。

PCR-DGGE检测GCG-R基因第二外显子

糖尿病是一种与遗传有着密切联系，并危害人类健康的常见病和多发病。最近，国外有人发现胰高血糖素受体（ＧＣＧ－Ｒ）基因上的一个错义突变与常见型非胰岛素依赖性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）高度相关。本文应用聚合酶链反应一变性梯度凝胶电泳技术（ＰＣＲ－ＤＧＧＥ）对２００例无亲缘关系中国昆明地区汉族人的ＧＣＧ－Ｒ基因第二外显子研究结果表明，所有研究对象均不存在错义突变。

荧光定量PCR与RT-PCR技术检测HCV-RNA的比较观察

目的 比较荧光定量 ＰＣＲ与ＲＴ－ＰＣＲ（定性）检测不同检材中的 ＨＣＶ－ＲＮＡ，评价荧光定量ＰＣＲ技术测定ＨＣＶ－ＲＮＡ水平的价值。方法 采用荧光定量ＰＣＲ及 ＲＴ－ＰＣＲ（定性）技术同时检测了７１例血液透析患者的血清、血浆、淋巴细胞、尿液标本中 ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果 血清、淋巴细胞、尿液标本中 ＨＣＶ－ＲＮＡ的荧光定量 ＰＣＲ检出率（４６．３８％、８５．５１％、８０．００％），分别高于相应标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ（定性）阳性率（２４．６４、２８．９９％、２０．００％），有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。血清、淋巴细胞中同时检出ＨＣＶ－ＲＮＡ的一致率，荧光定量ＰＣＲ法（３９．１３％）显著高于ＲＴ－ＰＣＲ定性法（８．７０％）（Ｐ＜０．００１）。ＨＣＶ－ＲＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ定性阳性率不随 ＲＮＡ定量水平均高而增高。结论与 ＲＴ－ＰＣＲ（定性）相比，荧光定量ＰＣＲ技术检测

重金属复合污染农田土壤DNA的快速提取及其PCR-DGGE分析

国内首次运用FastPrep○R 核酸快速提取系统提取了重金属复合污染农田土壤的DNA ,并对其进行了聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳 (PCR DGGE)分析。结果表明 ,FastPrep○R核酸提取仪与相应的FastD NASPINKitforSoil试剂盒联用时 ,能有效地分离到纯度较高的重金属污染农田土壤的DNA。PCR DGGE电泳图谱表明 ,PCR产物经DGGE检测后得到的电泳条带清晰且分离效果好 ,可以明显反映出重金属复合污染导致了农田土壤微生物在基因上的损伤 ,影响到农田土壤生态系统的细菌丰富度 ,改变了土壤环境的优势菌群 ,从而使农田土壤微生物群落结构多样性发生变化。可见 ,FastPrep○R核酸提取系统同样适用于重金属污染农田土壤环境中微生物基因组DNA的快速分离和纯化 ,得到的DNA可直接用于PCR DGGE分析。

番茄环斑病毒的普通RT-PCR和巢式PCR检测方法

根据番茄环斑病毒(ToRSV)外壳蛋白(CP)基因的保守序列设计了2对引物(引物对I和II),利用RT-PCR分别扩增出预期大小的800bp和580bp的条带,其中引物对II扩增效率较高、特异性较好。以引物对I和II进行2轮PCR扩增,建立了巢式PCR检测方法,其灵敏度比普通RT-PCR提高100～200倍。序列测定和分析表明所测定的序列为ToRSVCP基因的部分序列,在系统关系树上与ToRSV的其他分离物形成一簇,亲缘关系很近。

16S rDNA PCR-RFLP分析鉴定开菲尔发酵剂中的乳酸菌

对传统乳制品开菲尔发酵剂通过菌种分离和纯化得到67株乳酸菌,经过传统形态学分类区分成6种形态类型。在此基础上进行16S r DNA限制性片段长度多态性聚合酶链反应(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)分析法鉴定为4种分子类型,分别为:乳明串株菌(L.lactis)、坚强肠球菌(E.durans)、意大利肠球菌(E.italicus)、嗜热链球菌(S.thermophilus)。其中坚强肠球菌菌数超过50%,占所分离菌株的62.7%,为优势菌。

应用PCR-DGGE技术构建不同酵素微生物指纹图谱的初步研究

本文利用PCR-DGGE技术分析对比了不同酵素的微生物群落结构,从原始样品中直接提取总DNA,并对其16S r DNA的V3区进行扩增。通过分析发现,6种不同酵素中大约有5种优势菌群,相互之间存在一定联系且相互之间差异性不大。通过分析DGGE图谱与系统发育树的结合,能为观察微生物菌落结构提供直观的图谱,由此可见,PCR-DGGE技术是研究发酵食品及其它天然微生态样品的先进方法。

MC1R基因TaqⅠPCR-RFLP标记与他留乌骨鸡羽色性状的相关性研究

采用PCR测序与PCR-RFLP技术,研究了MC1R基因变异与他留乌骨鸡羽毛颜色的关系。通过对他留乌骨鸡麻羽、白羽和黑羽3个品系的MC1R基因PCR扩增与测序,检测到6个SNP位点,其中5个位点引起氨基酸变异。在分析以上SNP在不同羽色品系等位基因频率差异及SNP变异特性的基础上,在A356G(D119G)位点建立了TaqⅠPCR-RFLP分子标记,对所有受试个体进行基因分型,并对A356G变异与羽色性状相关性进行了相关分析。结果表明,MC1R基因是影响他留乌骨鸡羽色的一个主效基因,A356G SNP是控制鸡羽色的一个关键变异位点。

贝氏贝诺孢子虫巢式PCR检测方法的建立

根据Gen Bank上发表的贝氏贝诺孢子虫核糖体内转录间隔区(ITS)序列,在传统PCR方法的基础上设计一对特异性内引物,提取病牛血液中贝氏贝诺孢子虫基因组DNA,建立了贝氏贝诺孢子虫巢氏PCR检测方法并进行临床样品检测。结果表明,建立的巢式PCR检测方法能检测到贝氏贝诺孢子虫DNA的最低浓度为24.3 ag·μL-1,刚地弓形虫、犬新孢子虫、牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、边缘无浆体DNA检测均为阴性。196份临床血液样本,检测出3份阳性,阳性率为1.53%。由此可见,研究所建立的巢氏PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,可用于牛贝诺孢子虫病的早期临床诊断。

新疆4种林木腐烂病菌PCR快速检测技术研究

【目的】建立新疆林木腐烂病菌的快速PCR检测方法,为新疆林木腐烂病的早期测报和防治提供技术依据。【方法】针对新疆林木腐烂病菌主要种苹果黑腐皮壳(Valsa mali),污黑腐皮壳(Valsa.sordida),Leucostoma niveum和Valsa.malicola的r DNA-ITS特异性区段设计属专化型引物和种特异性引物。【结果】属专化型引物VF/VR可以从腐烂病菌中扩增一条424 bp的条带,检测灵敏度为10 pg/m L;设计的4对种特异性引物分别可对4种腐烂病菌V.mali,V.sordida,L.niveum,V.malicola检测到263 bp、423 bp、307 bp、308 bp的条带,检测灵敏度均为10 pg/m L。【结论】采用腐烂病菌Valsa的r DNA-ITS特异性区段设计的引物及PCR方法,可用于新疆林木腐烂病的快速分子检测。

以Chelex^R100作为介质、一步法从贮存骨髓涂片中提取DNA作PCR分析

利用螯合型离子交换树脂Ｃｈｅｌｅｘ~Ｒ１００作为介质、一步法从已贮存数年的骨髓细胞涂片中提取用作ＰＣＲ分析的ＤＮＡ。共提取已经或未经瑞氏染色的骨髓涂片２０张，平均每片ＤＮＡ收获率１．２±０．４μｇ。ＤＮＡ分子量为２～６ｋｂ大小，适合用于ＰＣＲ分析，但不能用于ＳｏｕｔｈｅｒｎＥｐ迹分析。本法具有简便、省时、明显减少因操作引起的标本间ＤＮＡ交叉污染的机会。此法有利于临床上收集大量的、不同病期的血液病标本，进行分子生物学研究和回顾性诊断。

定性PCR方法检测转基因玉米MON810转化事件的研究

转基因玉米MON810(Yield Gard R)是孟山都公司通过DNA重组技术和微注射轰击研发的一种具有对欧洲玉米螟(ECB;Ostrinia nublialis)有特殊抗性的转基因玉米品系,目前在世界各地已经得到广泛种植,为加强对该品系玉米的安全管理,本研究旨在建立MON810品系玉米的转化事件特异性定性PCR检测方法。根据MON810的插入序列信息,在3′端的侧翼序列处设计定性PCR检测的引物,检测MON810在其他几种常见转基因作物混合样品的特异性。结果表明,该方法具有很好的特异性。同时检测该引物系统的扩增灵敏度,结果表明,检测引物的灵敏度可达0.1%。建立的MON810特异定性PCR检测方法经全国7家实验室的验证,进一步证实该方法能够特异地检测出样品中的MON810转化事件,检测方法的灵敏度可达0.1%,且检测结果具有良好的可重复性和可重现性。MON810转化事件定性PCR检测方法的建立可满足于抗虫转基因玉米MON810及其衍生品种生物安全管理的需要。

AmpFlSTR~ Identifiler~ Plus试剂盒快速直接PCR扩增初探

目的探索可应用于法医实践的快速直接PCR扩增方法,以缩短扩增时间,提高STR分型速率。方法联合运用AmpF詛STRR○IdentifilerR○Plus试剂盒与TaKaRa快速PCR检测试剂构建快速直接PCR体系,以FTA血卡为模板,采用优化后的扩增程序在快速PCR仪上进行扩增,分型结果与常规直接扩增方法相比较。结果 AmpF詛STRR○IdentifilerR○Plus试剂盒与TaKaRa的快速PCR检测试剂针对血卡的联合扩增,所得STR分型结果与常规方法一致,扩增用时由常规直接扩增所需的175 min缩短为55 min。结论采用快速直接PCR方法进行扩增,可得到与常规直接扩增一致的DNA分型,扩增时间明显缩短,DNA分型速率大幅提高。

利用PCR技术鉴别畜禽肉中禽源性成分研究

为了建立一种快速、特异的禽源性成分检测方法,以线粒体16S r RNA基因序列为靶位点设计鸡、鸽、鹌鹑特异性引物,以常见畜禽肉(包括羊肉、牛肉、猪肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等)DNA为模板,进行PCR扩增和特异性检测。结果表明,筛选的引物能够有效地对动物源性成分进行检测,方便简洁,可快速鉴别畜禽肉食品中含有的鸡源性、鸽源性、鹌鹑源性成分。

旱稻Tail-PCR技术主要影响因素的优化和验证

以转基因旱稻为材料,对Tail-PCR方法进行了分析优化,包括DNA样品质量、扩增产物稀释程度、酶的种类、简并引物组合方式、引物结合偏好性等。结果表明,DNA样品质量的高低是影响试验成功的重要因素,样品纯度不高导致扩增无法正常进行;扩增后对产物稀释不充分会影响下轮扩增效果,适当增大产物稀释倍数可在下轮扩增中增大出带可能;LA Taq酶与普通Taq酶相比扩增效果没有明显不同,使用普通Taq酶即可进行Tail-PCR扩增;混合简并引物在旱稻中并没有获得更好的扩增效果。此外,发现简并引物对于不同物种存在偏好性,常规4种简并引物与旱稻基因组均可高效结合。优化后的Tail-PCR技术结果稳定,重复性好,可以准确地获得转基因旱稻插入位点的旁侧序列。

16 S rRNA 基因PCR对新生儿败血症的诊断研究

目的：探索快速可靠的新生儿败血症诊断的新方法。方法：通过自行设计合成细菌１６ＳｒＲＮＡ基因高度保守区引物，对２０种标准菌株、１２种２７株临床分离细菌基因组ＤＮＡ及巨细胞病毒进行ＰＣＲ扩增。结果：细菌具有３７１ｂｐ扩增产物，与人基因组ＤＮＡ、巨细胞病毒无交叉阳性反应，ＰＣＲ最低能检测１ｐｇ大肠杆菌ＤＮＡ。结论：建立了用共同引物ＰＣＲ扩增诊断败血症病原菌的方法，检测快速，特异性、敏感性高。

人R_O蛋白(60kD)编码序列的PCR产物在E.coli中的克隆与表达

通过聚合酶链反应 ( PCR)自人脾 c DNA扩增 RO 蛋白 ( 60 k D)编码 DNA片段 .将该片段定向插入麦芽糖结合蛋白 ( MBP)融合系统的 p MALTM- c载体中并转化 E.coli ( DH5α) ,通过酶联免疫印迹 ( IBT)筛选出具有 RO 抗原性的阳性克隆 .绝大部分阳性克隆表达完整的 RO 融合蛋白 ( 1 0 0k D) .但在传代过程中表达水平很快降低 ;少数阳性克隆虽然表达非完整 RO 融合蛋白 (分子量 <80k D) ,但表达水平却高而且稳定 .同时保留了很强的 RO 抗原性 .产生非完整融合蛋白的一个原因是 ,PCR碱基错配引起 RO 编码 DNA的序列缺失 ;

荧光定量PCR法对糖尿病大鼠肾脏BAX基因表达的检测

目的:对单肾切除糖尿病大鼠肾脏中BAX基因mRNA的拷贝数进行精确定量,以探讨糖尿病肾病的发病机制。方法:以SYBRGreenI作为定量检测中荧光染料,采用实时荧光定量PCR法,对单肾切除糖尿病模型组和单肾切除对照组大鼠肾脏中BAX基因的转录水平进行检测。结果:糖尿病模型组中BAX转录拷贝数明显高于对照组。结论:糖尿病大鼠肾脏中存在BAX基因的转录异常,细胞凋亡亢进可能参与糖尿病肾病的发生发展。

石蜡包埋组织直接原位PCR法的优化方法

目的探索一种行之有效的石蜡包埋组织直接原位PCR反应体系和反应条件的优化方法。方法采用免疫组化Envision法筛选出κ抗体表达阳性的霍奇金淋巴瘤1例,采用直接原位PCR法,5’-生物素标记的Vκ1/Jκ124、Vκ2/Jκ124、Vκ3/Jκ3、Vκ4/Jκ124、Vκ5/Jκ5、Vκ6/Jκ混合等6对κ家族特异性引物对该例霍奇金淋巴瘤组织中H/R-S细胞的κ轻链基因重排情况进行检测。结果①免疫组化Envision法筛选出κ抗体表达阳性结节硬化型霍奇金淋巴瘤1例;②直接原位PCR法检测该例霍奇金淋巴瘤组织中H/R-S细胞表达Vκ3/Jκ3,探索出了一种行之有效的石蜡包埋组织直接原位PCR反应体系和反应条件的优化方法,并有效的减少了干片、脱片现象的发生。结论本实验采用的直接原位PCR法的优化方法,在石蜡包埋组织中进行直接原位PCR是切实可行和有效的。

猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株与JXA1-R疫苗株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立及应用

为鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)类NADC30毒株HNhx和JXA1-R疫苗株,根据类NADC30毒株HNhx和JXA1-R疫苗株非结构蛋白2(Nsp 2)基因序列差异,设计特异性引物和探针,建立TaqMan荧光定量PCR和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,2种方法中,标准品在10^(3)~10^(8)拷贝/μL均具有良好线性关系,标准曲线R^(2)值均在0.990以上;基于TaqMan探针法的荧光定量PCR方法,JXA1-R株、HNhx株的最低检出量分别为10^(4)、10^(3)拷贝/μL,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的最低检出量均为100拷贝/μL;重复性分析结果显示,批内和批间试验的变异系数均小于1.5%,呈现出良好重复性。综上,成功建立了鉴别检测类NADC30毒株HNhx和JXA1-R疫苗株的方法,且稳定性好、特异性强,可以为PRRSV的鉴别检测提供技术支持。