应用Q-PCR定性检测KIR基因有无方法的建立

目的建立定性检测KIR基因有无的Q-PCR方法。方法根据高分辨水平中国人群KIR等位基因的多态性,并参考国际IPD-KIR数据库,针对16种KIR基因及2DS4-Normal、2DS4-Deleted两种亚型,设计KIR基因特异性引物用于Q-PCR扩增反应;同时设置一孔阴性对照、一孔阳性对照(特异性扩增人体生长激素HGH基因片段),以监控假阳性、假阴性的结果。为验证Q-PCR方法的可靠性,随机选择302份已采用KIR PCR-SSP商品化试剂盒检测的标本,采用Q-PCR方法盲检和对比。结果300人份的Q-PCR检测结果与已知的PCR-SSP检测结果相符,有2份标本结果不一致,其中1例标本的2DS5基因Q-PCR检测结果为阴性,而PCR-SSP检测结果为阳性;另一例标本2DS1基因Q-PCR检测结果为阳性,而PCR-SSP检测结果为阴性。对2份标本分别进行2DS5、2DS1基因测序分型,证实Q-PCR定性检测结果正确。结论本文建立的KIR Q-PCR方法结果准确、可靠,可用于KIR基因有无的定性检测。

序列特异引物引导的聚合酶链式反应(PCR-SSP)结合血清学在疑难血型鉴定中的应用

目的 探讨血型血清学与序列特异引物引导的聚合酶链式反应(PCR-SSP)基因分型在ABO疑难血型鉴定中的作用。方法 用血清学分析鉴定的ABO疑难血型标本80例,同时采用PCR-SSP法进行基因分型,结合两种方法学结果,确定血型及制定输血策略。结果 血清学鉴定亚型40例,其他原因引起的抗原抗体缺失或减弱正常血型40例;PCR-SSP法基因分型亚型41例(3例二者结果不一致:血清学Ael型1例,基因分型O2O2;血清学O型1例,基因分型BO1;血清学A型1例,基因分型AB),正常血型39例。结论 使用血清学结合基因分型鉴定ABO疑难血型具有重要意义。

一种新的HLA─Ⅱ类基因分型方法——PCR／SSP技术的建立

ＰＣＲ／ＳＳＰ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒ，序列特异性引物）是一种新的基因多态性分析技术，可用于ＨＬＡ复合体及其他具有多态性特点的基因分型。我室于１９９３年建立这种方法，并对正常人、重症肌无力患者、全身性红斑狼疮患者、骨髓移植供／受者进行了ＨＬＡ－ＤＲＢ１、－ＤＱＢ１基因型别分析。与其它ＨＬＡ基因分型方法相比，ＰＣＲ／ＳＳＰ具有简便、快速、准确及重复性好等特点。本文介绍ＰＣＲ／ＳＳＰ技术的原理、方法、特点以及常见问题的处理。

PCR-SSP法检测A^(1,2)BO^(1,2)血型基因型

目的 为了建立A1,2 BO1,2 血型系统基因分型的方法 ,以检测人群中A1、A2 、B、O1、O2 基因的频率。方法 采用盐析法进行样品DNA的抽提 ,采用PCR SSP法进行A1,2 BO1,2 血型基因分型。结果 15 8例中A1,2 BO1,2 系统基因频率分别是A1为 18 7% ,A2 为 0 6 % ,B为 17 4% ,O1为 6 2 3% ,O2 为 0 9%。结论 该方法可鉴定出A1,2 BO1,2 血型系统基因 ,中国人群中存在O2 基因。

PCR-SSP技术应用于海南汉族HLA-A、B、DRB1基因多态性研究

[目的]研究海南汉族HLA-A、B、DRB1基因多态性,分析该群体HLA等位基因分布特点。[方法]应用顺序引物聚合酶链反应技术对3140名海南汉族健康、无血缘关系的捐献造血干细胞血样者进行HLA-A、B、DRB1基因分型检测,并与其他汉族群体进行比较。[结果]检出A等位基因17个,B等位基因28个,DRB1等位基因13个。其中HLA-A*11(0.3553)、A*02(0.2873)、A*24(0.1946)、A*33(0.1045)、HLA-B*40(0.1896)、B*15(0.1526)、B*13(0.1451)、B*46(0.1285)、B*58(0.1018)、HLA-DRB1*15(0.1649)、DRB1*12(0.1414)、DRB1*04(0.1336)、DRB1*09(0.1287)等位基因具有较高的基因频率。[结论]海南汉族HLA等位基因多态性具有南方汉族人群共同的特征,但可能受北方汉族的影响,具有自身的特点。

PCR-SSP对潜在输血需要住院患者ABO基因分型的检测效果与意义

【目的】调查潜在输血需要住院患者的ABO血型基因,分析ABO表型相同输血中ABO基因型的错配输血几率。【方法】对502例潜在输血需要的住院患者,采用血清学方法和聚合酶链反应-序列特异性扩增技术(PCR-SSP)检测ABO血型的表型及基因型。比较两种方法学对ABO血型表型的一致率;统计各ABO等位基因及各ABO基因型的频率;并分析潜在输血需要的住院患者在接受ABO血型表型相同的输血时,ABO基因错配输血几率。【结果】血清学与PCR-SSP对502例潜在输血需要的住院患者的ABO表型识别的一致率为100%。PCR-SSP技术检测出患者中常见ABO基因5个(O1、O2、A1、B1及A2)以及ABO基因型16个(O1O2、O1O1、B1O1、A1O1、A1O2、B1O2、O2O2、A1B1、A1A1、B1B1、A2O1、A2O2、A2B1和A1A2),而血清学仅能识别ABO表型。潜在输血需要住院的患者在接受ABO血型表型相同的随机输血中,与供者之间ABO基因型的错配率分别为:A型65.98%,B型57.39%,O型56.95%,AB型22.55%。【结论】PCR-SSP能识别ABO基因型,不仅可以作为血清学的有力补充,而且可能揭示输血治疗中不明原因的输血不良反应的临床原因,具有重要临床意义。

用PCR-SSP对HLA-DQB作中分辨法分型

采用PCR-序列特异性引物技术(SSP)对HLA-DQB作中分辨法分型。该方法不仅可行,且操作简便快速,结果准确,适用于临床器官移植配型。

流式细胞术与PCR-SSP法检测HLA-B27的比对及HLA-B27亚型的研究

目的探讨流式细胞术(FCM)与序列特异性引物聚合酶链式反应(PCR-SSP)在人类白细胞表面抗原-B27(HLA-B27)检测中的应用,并观察HLA-B27亚型在本地区的分布情况。方法采用PCR-SSP和FCM检测88例疑似强直性脊柱炎(AS)患者HLA-B27。结果 88例AS疑似患者中FCM法检测HLA-B27结果阳性82例,阴性6例,阳性率为93.2%;PCR-SSP法检测阳性83例、阴性5例、阳性率为94.3%。分型结果 B*2705型41例占49.4%;B*2704型37例占44.5%;B*2702型1例占1.2%;阳性但未分辨型别4例。结论 Kappa一致性系数K=0.905,PCR-SSP法与FCM检测HLA-B27结果具有较高的一致性。本地区易感HLA-B27等位基因亚型主要以HLA-B*2704和HLA-B*2705为主。

多重PCR-SSP方法在RHD基因检测中的应用

目的应用分子生物学诊断方法分析RhD阴性献血者的RHD基因。方法首先采用多重PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)方法扩增377名RhD阴性无偿献血者的RHD基因特异性内含子4和外显子7,对扩增结果为阴性的标本则继续采用PCR-SSP检测RHD基因启动子和外显子10。结果 337名RhD阴性无偿献血者中,24.92%(84/337)为RHD基因内含子4和外显子7阳性,余253例内含子4和外显子7阴性标本中的8.69%(22/253)为启动子和外显子10阳性;本组RhD阴性无偿献血者的RHD基因阳性率为31.45%(106/337)。结论多重PCR-SSP方法检测RHD基因简单易行,可用于对血清学RhD阴性者的RHD基因确认。

PCR-SSP法检测胎儿、新生儿ABO血型

目的 研究用PCR SSP法鉴定胎儿、新生儿血型及基因型。方法 用PCR SSP法检测 5 6例 16周以上孕妇的胎儿、新生儿脐血红细胞基因型 ;用常规法检测双亲及胎儿、新生儿血红细胞ABO血型。结果 用PCR SSP法检测出全部 5 6例脐血ABO血型及基因型 ;PCR SSP法检测出的子代血型与由父母血型按孟德尔遗传规律推测的子代血型符合率达 10 0 % ;用常规法检测脐血ABO血型 ,检出率为 87.5 %。结论 PCR SSP法检测子代ABO血型方法可靠 。

PCR-SSP基因分型技术检出HLA-B新等位基因B＊5516一例

目的 识别确认中国人群的HLA新等位基因。方法 使用PCR SSP以及以测序为基础的分型技术 ,分析HLA新等位基因和B 5 5 0 2基因顺序的差异及血清学方法分析特异性。结果 在四川成都骨髓供者中检测出一例新的HLA B等位基因。该基因和B 5 5 0 2基因顺序的差异 ,只是在外显子 2区域中 97C >A一个碱基取代 ,导致相应的密码子 33由酪氨酸变为组氨酸。血清学分析表明B 5 5 16与B2 2特异性相关。并由此建立起PCR SSP方法鉴定B 5 5 16基因。结论 四川成都骨髓库中检出的HLA B等位基因是HLA新等位基因 ,2 0 0 3年 8月已被世界卫生组织 (WHO)命名为HLA B 5 5 16。在大约 14 0 0例随机骨髓供者中 ,未发现其他带有B 5 5 16基因的个体。

人类血小板抗原HPA-15系统PCR-SSP基因分型技术的建立

本研究目的是采用PCR-SSP技术建立人类血小板抗原HPA-15系统的基因分型方法,并应用于血小板供者库的HPA基因定型。采用第11届国际输血协会(ISBT)血小板血清学与基因分型协作组推荐的序列特异性引物,调节引物浓度、Mg2+离子浓度和探索最佳PCR扩增条件,建立HPA-15系统基因分型技术。该分型技术的准确性和可靠性,采用第11届ISBT血小板协作组提供的质控样本进行验证,同时采用本研究合成的引物及商品化试剂盒,对50名随机的汉族血小板捐献者进行HPA-15系统基因分型,作为平行对照。应用本研究的方法,对第11届ISBT送检的10份考核样本进行基因分型。结果表明:基因分型结果与ISBT公布的结果完全一致。50名随机的血小板志愿捐献者,经本研究的方法及美国G&T公司的试剂检测,基因分型的结果相符合;观察到的基因频率:HPA-15a和-15b分别为0.5100和0.4900。结论:本研究建立的HPA基因分型技术具有简便、快速、准确的特点,适合于常规HPA基因分型,具有广泛的应用前景。

PCR－SSP快速检测胰腺癌石蜡切片中K－ras基因点突变

胰腺癌第１２位点Ｋ－ｒａｓ基因点突变检出率达７２％～１００％，检测其点突变方法有数种。我们采用针对Ｋ－ｒａｓ基因点突变方式设计的引物，对胰腺癌石蜡包埋组织进行多聚酶链反应（ＰＣＲ），产物借助常规电泳即可判定有无Ｋ－ｒａｓ基因突变及突变方式，无需酶切、杂交、放射性及非放射性显影等技术。研究发现：３１例胰腺癌标本有２３例存在Ｋ－ｒａｓ基因点突变，方式分别为ＣＧＴ、ＧＡＴ、ＧＴＴ，而９例正常胰腺组织、１９例胰腺良性疾病、７例胆管癌及４例十二指肠乳头癌均未见Ｋ－ｒａｓ基因突变。该法简便、快速、特异、灵敏，易临床推广应用，可以作为胰腺病变良恶性鉴别的一种新方法。

应用SSP-PCR/SSO方法进行中国辽宁汉族人HLA-DRB1基因的遗传多态性研究

对１５９名中国辽宁汉族个体的基因组ＤＮＡ进行分析，共检出４２种等位基因，其中以ＤＲＢ１０９０１２（１２．８％）、０７０１（１０．７％）、１５０１（１０．４％）最为常见，其次为ＤＲＢ１１２０１（７９％）、１２０２（７５％）、１１０１（６６％）、０３０１（５．０％）。并发现辽宁汉族人ＤＲＢ１等位基因频率与白种人间存在明显差异，揭示不同人种有其自己的主要等位基因。

应用PCR-SSP进行HLA-AB基因分型及与血清学方法的比较

目的 建立HLAI类基因分型技术并应用于骨髓配型。方法 采用序列特异性聚合酶链反应 (PCR SSP)进行HLA AB基因分型 ,并与HLAI类血清学分型 (微量淋巴细胞毒试验 )进行比较。结果 运用PCR SSP技术共对 2 2例需骨髓移植的病人和 48例供者进行基因分型 ,2例病人确认了HLA完全匹配的亲缘骨髓供者 ,其中 1例已成功进行了骨髓移植 ;基因分型和血清分型比较 ,43例结果完全一致 (6 1.4% ) ,血清分型错误率高达 38.6 % (2 7/ 70 )。结论 PCR SSP分型技术具有准确性高 ,简便快速等优点 。

血型血清学和PCR-SSP方法在ABO疑难血型鉴定中的互补性应用

目的探讨血型血清学技术和聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法在ABO疑难血型鉴定中的互补性应用。方法采用血型血清学方法对14例ABO疑难血型标本做正反定型(必要时进一步做吸收放散试验),同时采用PCR-SSP方法对其做ABO基因分型。结果 14例ABO疑难血型标本的血清学检测:Bx型3例,B(A)、AB3型各2例,Bend、B3、AxB、ABx和Bel型各1例;另有2例为AB型伴抗原减弱(不排除疾病等因素影响)。PCR-SSP方法分型:得到7例ABO亚型基因,分别为Bx02O01、B(A)02O02、AB305、AB303、ABw12、Bw12O02和Bw12O01;7例正常的ABO基因,AB1、B1O01各3例,B1O02型1例。结论 PCR-SSP方法在疑难血型鉴定中的应用有助于输血前检查中ABO血型血清学结果的补充。

应用PCR-SSP方法检测HLA-B27亚型及其临床意义

[目的]通过PCR-SSP方法对HLA-B27亚型进行检测,探讨其与强直性脊柱炎(AS)的相关性,并对大连地区B-27分型情况进行研究。[方法]对40例确定为HLA-B27阳性的样本(临床诊断28例AS,12例非AS)采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)检测方法进行HLA-B27亚型分型。[结果]40例样本用PCR-SSP方法检测均获成功。共检出4种亚型:B2704、B2705、B2702和B2710。B2704 23例占57.5%(23/40例);B2705 14例占35%(14/40例);B2702 2例占5%(2/40例);B2710 1例占2.5%(1/40例)。28例AS标本与12例非AS标本中B2704、B2705所占比例统计学分析无显著差异(B2704χ2=0.5894,P>0.05;B2705χ2=0.02,P>0.05)。[结论]PCR-SSP方法对HLA-B27基因分型,分辨度高、特异性强、快捷、准确,适合于临床应用。HLA-B27亚型的检测可作为强直性脊柱炎诊断(AS)的重要的参考指标。大连地区HLA-B27亚型以B2704和B2705为主并出现1例B2710型。

用PCR-SSP方法分析南方汉族人群MICA基因多态性

目的 调查南方汉族人群MICA基因外显子2-6的多态性。方法 采用聚合酶链反应／序列特异性引物（PCR-SSP）方法，调查113例江苏省扬州地区汉族正常人群MICA等位基因的分布情况。结果 共检测出18个MICA等位基因，最常见的3种等位基因分别是MICA＊008（23．0％），MICA＊010（17．6％）和MICA＊002／020（11．2％），最罕见的3种等位基因是MICA＊042（0．4％）。MICA＊045（1．3％）和MICA044（1．3％）。结论 中国南方汉族人群MICA等位基因分布频率具有自己的种族特异性。

用PCR-SSP分析HLA-B位点血清学分型困难标本

目的 :对血清学HLA B位点分型困难标本用PCR SSP方法分析 ,并寻找血清分型效果不佳原因。方法 :用本室建立的PCR SSP方法对 10 0株标准细胞及 91份血清学分型困难标本分别作HLA B位点分析 ,前者作为PCR SSP方法的参考对照品。结果 :10 0株标准细胞分析结果与已知结果一致 ;91份疑问标本均顺利地用PCR SSP分型 ,结果共有 70种等位基因格局 ,其中 36种与血清学完全不同 ,占 5 2 %。PCR SSP还检出了一些原先认为上海人中空白的基因 ,如B49。结论 :从PCR SSP分型结果推断血清学部分标本分型结果不佳的原因是缺少单价抗血清 ;同一交叉反应组内错检 ;反应强度不当 ,导致结果难辨 ;操作中跨孔污染。而PCR SSP就没有这方面的问题。证实了本室建立的PCR SSP法可作为准确可靠的HLA

HLA类基因PCR-SSP分型技术在骨髓移植配型中的应用

目的建立快速、准确的 HL A基因分型方法 ,满足临床移植配型的需要。方法通过序列特异性引物聚合酶链反应 (PCR- SSP) ,对拟行骨髓移植的 10例血液病患者及 12名相关供者的 HL A- 类基因 DRB1,DQB1位点扩增 ,琼脂糖凝胶电泳分析 PCR产物并确定其基因型。结果发现 2例患者与其相关供者 HL A- DRB1,DQB1基因全相同 ,其中 1例成功进行了骨髓移植。结论该方法具有快速准确、特异性高、简便省时的特点。