抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性定性PCR检测方法的建立及其标准化

抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5已经批准获得我国进口用作加工原料的安全证书,含有外源HaHB4基因和bar标记基因。本研究根据抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体5′端和3′端插入位点旁侧序列信息,设计19对引物,结合罗萨里奥农业生物技术学院公司的1对引物,针对20对引物组合利用定性PCR技术进行引物特异性筛选,结果显示5′端的14号引物特异性良好,优化后获得最佳反应体系和反应程序;经测试,该引物特异性好、稳定性高,检出限达0.1%,扩增片段大小248 bp。经8家有资质实验室对本方法的特异性、检出限、重复性和再现性进行验证,各项参数均达到国家标准要求。本研究成功建立了抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体定性PCR检测方法,为IND-ØØ41Ø-5转化体在国内的安全监管提供技术支撑。

羊种布氏杆菌M5-90△26基因缺失疫苗双重实时荧光定量PCR方法的建立

为了寻找一种能够鉴别布氏杆菌M5-90△26疫苗株与其他布氏杆菌菌株的双重实时荧光定量PCR检测方法。针对布氏杆菌菌株的16S rRNA和Bp26基因,各设计一套引物和探针,并优化反应体系和反应程序。以布氏杆菌A19、S2、M5-90和M5-90△26四种疫苗株以及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、沙门氏菌、链球菌进行双重荧光定量PCR扩增,评价该方法的特异性。克隆构建PCR_16S rRNA_Bp26标准品,通过倍比稀释进行双重荧光定量PCR扩增,评价该方法的灵敏度。使用该方法与虎红平板凝集试验、试管凝集试验进行检测结果对比,评价该方法的可行性。结果显示,本方法特异性好,布氏杆菌A19、S2、M5-90三种疫苗株均同时出现Bp26基因和16S rRNA基因的扩增,布氏杆菌M5-90△26疫苗株只出现16S rRNA基因的扩增,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、沙门氏菌、链球菌均未出现扩增曲线。该方法建立的16S rRNA基因序列扩增通道和Bp26基因序列扩增通道对标准品的最低检测限均达5 copies/μL。该方法对临床样本的检测结果与虎红平板凝集试验、试管凝集试验检测结果符合率较高,说明建立的羊种布氏杆菌M5-90△26基因缺失疫苗双重实时荧光定量PCR检测方法可用于临床的检测,为鉴别布氏杆菌M5-90△26疫苗株免疫与布氏杆菌野毒株感染提供一种可行的检测方法。

绵羊线粒体DNA控制区5’端序列PCR-SSCP与序列分析

通过绵羊线粒体ＤＮＡ控制区左功能域（５’端序列）ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和序列分析，发现小尾寒 羊、乌珠穆沁羊、湖羊、萨福克羊和夏洛来羊以及多赛特公羊与小尾寒羊杂交家系共２０２只绵羊 可归纳为两种类型：突变型和野生型，提示现代绵羊品种在起源上存在两种主要的进化途径。

浓香型大曲真核微生物群落的PCR-SSCP解析

通过PCR-SSCP分析了浓香型大曲发酵过程中7个曲样中真核微生物群落的变化情况,结果表明:在大曲发酵过程中,微生物群落结构复杂,变化多样,不同微生物群落具有协同和制约的复杂生态学效应,并与外界因素相互作用,共同对大曲发酵过程产生影响。大曲发酵过程中温度的升高,对真核微生物多样性的影响较大。

猪雌激素受体基因(ESR)点突变的PCR-SSCP检测

雌激素受体基因(ESR)是控制猪高产仔数的主效基因之一,具有明显的基因效应:BB型比AA型母猪胎总产仔数和产活仔数分别高出1 40～3 37和0 63～3 58头,是目前商品猪育种和生产中重点检测的主要基因之一。常规采用PCR -RFLPs方法区分该基因由点突变造成的3种不同的基因型。本研究建立1种基于PCR的SSCP(single-strand edconformationpolymorphism)方法对猪ESR该位置的点突变进行检测,具有操作简便、灵敏度高和不需要酶切等优点 。

FSHβ基因PCR-SSCP多态性及其与济宁青山羊高繁殖力关系的研究

采用PCR-SSCP技术检测促卵泡素β亚基(follicle-stimulatinghormoneβ,FSHβ)基因5′调控区、外显子1和外显子2在高繁殖力山羊品种(济宁青山羊)和低繁殖力山羊品种(辽宁绒山羊、波尔山羊、安哥拉山羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响。结果表明:山羊与绵羊的FSH基因该段核苷酸序列同源性为98%。9对引物中,只有P9的扩增片段存在多态性。P9的扩增片段在济宁青山羊和辽宁绒山羊中检测到AA、AB和AC3种基因型;在波尔山羊中检测到AA、CC和AC3种基因型;在安哥拉山羊中检测到AA、BB、CC、AB、AC和BC共6种基因型。测序分析发现BB型与AA型相比在外显子2的第94bp处有G→A突变,并引起氨基酸改变(丙氨酸→苏氨酸);CC型与AA型相比在外显子2的第174bp有一处C→T沉默突变。济宁青山羊AA、AB和AC基因型频率分别为0.686、0.137和0.177。AA基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比AB基因型的多0.78只(P<0.05),比AC基因型的多0.64只(P<0.05)。

山羊生长分化因子9基因外显子2的PCR-SSCP分析

目的寻找与产羔数相关的遗传标记,为山羊高繁殖力的标记辅助选择提供科学依据。方法以控制Belclare绵羊和Cambridge绵羊高繁殖力的生长分化因子9(growthdifferentiationfactor9,GDF9)基因为候选基因,根据绵羊GDF9基因序列设计4对引物,采用PCR-SSCP技术检测GDF9基因外显子2在高繁殖力山羊品种(济宁青山羊)以及低繁殖力山羊品种(波尔山羊、文登奶山羊、辽宁绒山羊、北京本地山羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响。结果山羊与绵羊的GDF9基因外显子2核苷酸序列同源性为99%(955/965)。引物1和引物4存在多态性。对于引物1扩增片段,5个山羊品种均检测到AA、AB和BB3种基因型,测序分析发现外显子2第26bp处有1个G→A的单碱基突变,但没有引起氨基酸改变;济宁青山羊A等位基因频率为0.9128,B等位基因频率为0.0872;AA基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比AB基因型的多0.54只(P<0.01),比BB基因型的多0.63只(P<0.01)。对于引物4扩增片段,5个山羊品种均检测到CC、CD和DD3种基因型,测序分析发现外显子2第792bp处有1个G→A的单碱基突变并且导致缬氨酸改变为异亮氨酸;济宁青山羊C等位基因频率为0.9266,D等位基因频率为0.0734;CC基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比CD基因型的多0.57只(P<0.01),比DD基因型的多0.62只(P<0.01)。结论初步表明GDF9基因可能是控制济宁青山羊多胎性能的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的分子标记。

松材线虫rDNA的测序和 PCR-SSCP分析

本文为克服形态鉴定的不足 ,用分子生物学的方法鉴别松材线虫。线虫核糖体 DNA(r DNA)的内部转录间隔区 (ITS1)区 (约 30 8bp)的测序结果显示 :松材线虫种内区别很小 ,不超过 1bp;拟松材线虫种内区别较大 ,最大达 7bp;这 2种线虫的种间区别为 32～ 39bp。根据以上测序结果 ,本文结合单条线虫 DNA的提取技术 ,对 14个松材线虫和拟松材线虫样本进行了单链构象多态性 (PCR-SSCP)分析 ,结果表明 PCR- SSCP分析技术可明确区分这 2种线虫 ,该技术可为单条松材线虫的鉴定提供一套灵敏而可靠的方法。

瘢痕疙瘩Fas基因突变的银染PCR-SSCP检测

以前的研究提示：瘢痕疙瘩成纤维细胞的Ｆａｓ 受体可能处于无功能状态。进一步探讨导致无功能Ｆａｓ分子的可能机制。取瘢痕疙瘩、增生性瘢痕患者的组织及外周血标本，ＰＣＲ特异性扩增Ｆａｓ 分子外显子９ 的编码区，扩增产物经银染ＳＳＣＰ筛选，最后可疑阳性的ＰＣＲ样本进行ＤＮＡ 测序。经ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测，２０％ （２／１０）的瘢痕疙瘩组织中发现异常电泳带，经ＤＮＡ 测序证实，这２ 例突变均为位于Ｆａｓ ｃＤＮＡ的７５５ｂｐ 处的“Ａ”缺失而导致的移码突变。结果提示：编码Ｆａｓ分子死亡域结构基因的移码突变可能导致Ｆａｓ受体功能丧失，从而导致成纤维细胞的凋亡异常；该研究从基因水平阐述了瘢痕疙瘩发生的分子机制。

五指山、二花脸和皮特兰猪的SLA-DRB基因外显子2PCR-RFLP及PCR-SSCP多态性分析

采用PCR RFLP法和PCR SSCP法对 1 7头五指山猪、2 8头二花脸猪以及 2 8头皮特兰猪SLA DRB外显子 2进行分型。采用PCR RFLP技术分型 ,结果显示 :限制酶MspⅠ酶切可分出 1种RFLP带 ,即M :1 4 3bp/ 1 0 2bp ;限制酶RsaⅠ酶切可分出 4种RFLP带 ,分别为A :1 4 1bp/ 93bp/ 1 1bp ,B :1 1 1bp/ 6 9bp/ 5 4bp/ 1 1bp ,C :1 80bp/ 5 4bp/ 1 1bp以及D :93bp/ 4 8bp/ 39bp/ 5 4bp/ 1 1bp。检测发现 ,五指山猪有 2种RFLP带型 :AA和BB ,二花脸猪有 3种RFLP带型 :AA、BB和AB ,皮特兰猪有 3种RFLP带型 :AA、CC和BD。比较五指山猪、二花脸猪与皮特兰猪 ,发现 3个品种都是以A带为主 ,分别占到 0 6 9、0 73和 0 82 ,品种之间差别不显著。采用PCR SSCP技术共分出 7种标记带型 ,分别为αα、αδ、ββ、γγ、αγ、δδ、βε ,其中五指山猪有 3种带型 ,分别为αα、αδ和 ββ ,二花脸猪有 3种带型 ,分别为αα、γγ和αγ ,而皮特兰则出现 5种带型 ,分别为αα、δδ、αδ、βε和 ββ。在 3个品种猪中均存在α带 ,且其频率在各自品种中均最高 ,在五指山猪和皮特兰猪中δ带出现的频率次之 ,相应的在这两个猪种中杂合型αδ带型出现的频率则最高。Hardy Weinberg平衡分析表明 ,二花脸猪SLA DRB基因外显子

绵羊催乳素受体基因PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术分析了催乳素受体基因(PRLR)在小尾寒羊、萨福克羊、多赛特羊、多赛特公羊×小尾寒羊母羊F1代杂种羊4个绵羊群体中的多态性。结果表明:PRLR基因在3对引物扩增片段中均存在PCR-SS-CP多态性。对于引物1,4个绵羊群体均检测到AA基因型,AB基因型只出现在小尾寒羊、多赛特羊和萨福克羊中,仅在多赛特羊中检测到BB基因型。对于引物2,4个绵羊群体均检测到AA和AB基因型,只有萨福克羊没有BB型。对于引物3,4个绵羊群体均检测到AA、AB和BB基因型。在4个绵羊群体中,A等位基因频率均明显高于B等位基因频率。

鸡AMPD1基因PCR-SSCP分析与相关性状的研究

5′-磷酸腺苷脱氨酶1(AMPD1)是嘌呤代谢中的一种重要酶类,它的功能是催化AMP(一磷酸腺苷)脱氨,生成肌苷酸(IMP),从而影响肉质风味。试验采用单链构象多态性(PCR-SSCP)技术,以隐性白羽肉鸡、白来航蛋鸡和两个地方品种(北京油鸡、三黄胡须鸡)纯系鸡为试验材料,对AMPD1基因进行SNPs检测和基因类型判别。卡方检验结果表明: 除三黄胡须鸡和隐性白羽肉鸡、北京油鸡和白来航鸡间差异不显著(P>0.05)外,其他各品种间差异极显著(P<0.01)。AMPD1基因多态性与北京油鸡生产和屠体性状(活重、胸肌率、肌苷酸含量等)相关分析结果表明:肌苷酸含量在三种基因型间差异显著(P<0.05)。初步推断AMPD1可能为影响鸡肉中肌苷酸生成的主效基因或与主效基因相连锁。

中国人CTLA-4基因的PCR-SSCP和DNA序列分析

ＣＴＬＡ４是主要表达于成熟Ｔ细胞表面的蛋白分子，与Ｔ细胞参与的免疫应答负调控有关，目前有关ＣＴＬＡ４的分子生物学资料多为外国提供，为了掌握中国人ＣＴＬＡ４基因的第一手资料，我们对５０例中国人（其中２５例为正常人，２５例为类风湿性关节炎患者）的ＣＴＬＡ４基因Ｖ区进行了ＰＣＲ扩增，并对其中４例正常人进行了ＤＮＡ序列分析，结果显示中国人ＣＴＬＡ４Ｖ区的ＤＮＡ序列与国外报道有两个位点存在差异，其中第５４位密码子处中国人为ＡＴＧ（甲硫氨酸），第１１０位密码子处为ＡＣＣ（苏氨酸），进一步对正常人和类风湿性关节炎病人进行ＰＣＲＳＳＣＰ分析，结果显示在所分析的人群中不存在多态性，表明ＣＴＬＡ４分子具有高度保守性。

绵羊GnRHR基因部分序列PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术,用两对引物分析了GnRHR基因外显子2和外显子1部分序列在小尾寒羊、多赛特羊2个绵羊品种中的多态性。结果表明,对于引物1扩增片段,2个绵羊品种均只检测到AA基因型。对于引物2扩增片段,2个绵羊品种均检测到AA、AB基因型;小尾寒羊AA、AB基因型频率分别为0.83和0.17,多赛特羊AA、AB基因型频率分别为0.60和0.40。引物2的多态片段测序分析表明,位于GnRHR基因cDNA第230处发生了碱基的改变(G→C),该突变导致了氨基酸的改变(甘氨酸→半胱氨酸)。

奶牛乳铁蛋白基因5′侧翼区PCR-SSCP多态性分析

采用PCR SSCP技术 ,对奶牛乳铁蛋白基因 5′侧翼区 112 2bp序列进行多态性分析。在该区所划分的 5个亚片段上 ,发现Blf5′ 1(2 2 7bp) ,Blf 5′ 3(175bp)和Blf5′ 5 (2 93bp) 3个DNA片段存在多态。进一步对这 3个片段进行测序分析 ,在Blf 5′ 1序列中 ,发现位于转录起始位点上游 - 92 6和 - 915位分别有G→A及T→G点突变 ;在Blf5′ 3片段中 ,- 4 78位存在G的插入 ;Blf 5′ 5位点上 ,发生 - 2 8位的C颠换为A和 +33位的G颠换为C两处突变。利用TFSEARCH (ver.1 3)软件对乳铁蛋白基因 5′侧翼区潜在调控元件及蛋白质结合位点进行了预测 ,结果显示

绵羊GDF9基因PCR-SSCP分析

生长分化因子 9(GDF9)是由卵母细胞分泌的一种生长因子 ,它对早期卵泡的生长和分化起重要的调节作用。采用PCR SSCP技术分析了GDF9基因在小尾寒羊、湖羊、多赛特羊和萨福克羊 4个绵羊品种的多态性。结果表明 :GDF9基因在两对引物扩增片段中均存在PCR SSCP多态性。对于引物 1扩增片段 ,4个绵羊品种均检测到AA基因型 ,AB基因型只出现在湖羊、多赛特羊和萨福克羊中 ,仅在萨福克羊中检测到BB基因型 ;在 4个绵羊品种中 ,A等位基因频率明显高于B等位基因频率。对于引物 2扩增片段 ,4个绵羊品种均检测到AA基因型 ,AB基因型只出现在湖羊、多赛特羊和萨福克羊中 ,4个绵羊品种均没有检测到BB基因型 ;在 4个绵羊品种中 ,AA基因型频率最高 ,A等位基因频率明显高于B等位基因频率。引物 1的多态性片段测序分析表明 :位于GDF9基因cDNA第15 2处发生了单碱基的改变 (A→G) ,并导致了氨基酸的改变 (天冬酰胺→天冬氨酸 )。

PCR-SSCP技术的研究及应用进展

阐述了SSCP技术的建立与发展过程;概述了PCR-SSCP技术的原理、方法、优缺点及突变技术研究进展;总结了PCR-SSCP技术在多个领域中(动物育种、基因突变、基因诊断、基因图谱和连锁分析等)的应用情况;分析了PCR-SSCP技术在分子生物学研究领域中的作用。

新疆细毛羊和陕北细毛羊羊毛细度候选基因的PCR-SSCP分析

选取60只新疆细毛羊和48只陕北细毛羊,利用PCR-SSCP分子标记对其羊毛细度候选基因的5个位点(S1,S2,S3,S4,S5)进行了多态性分析。结果表明,2个绵羊品种在5个位点上A等位基因的频率均高于B等位基因。在S1,S5位点上,新疆细毛羊和陕北细毛羊均检测到AA,AB,BB 3种基因型;在S2位点上,新疆细毛羊检测到AA,BB,CC,DD 4种基因型,陕北细毛羊检测到AA,AB,BB 3种基因型;在S3位点上,新疆细毛羊检测到AA,AB 2种基因型,陕北细毛羊检测到AA,AB,BB 3种基因型;在S4位点上,新疆细毛羊和陕北细毛羊均检测到AA,BB 2种基因型。新疆细毛羊和陕北细毛羊的平均杂合度分别为0.445 0和0.399 7。新疆细毛羊P IC平均值为0.366 6,S1,S3,S4和S5位点均处于中度多态,而S2(P IC=0.555 1)处于高度多态;陕北细毛羊P IC平均值为0.318 9,5个位点均处于中度多态。以上结果表明,S1,S2,S3,S4和S55个位点可以作为有效的遗传标记用于优质细毛羊的遗传多样性分析,2个绵羊品种群体内的遗传变异程度高,遗传多样性丰富,选择潜力大。

采用UPPCR-SSCP技术快速鉴定水产养殖病原性弧菌的研究

采用通用引物PCR配合SSCP分析即UPPCR SSCP技术 ,对弧菌科弧菌属中的副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、费尼斯弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌的 1 6S RNA基因进行检测。结果发现 ,UPPCR SSCP技术能较好地鉴别细菌的不同种 ,但对同种不同株细菌的区分较困难。认为PCR SSCP是将病原菌判定至种的有力工具。此研究对水产养殖病原菌的快速诊断与及时防治有重要意义。

PCR-SSCP技术用于脱臭微生物群落结构的研究

采用PCR-SSCP（单链构象多态性）技术对脱臭生物滤池中填料生物膜微生物群落结构进行了研究.生物滤池对臭气中的污染物随驯化时间逐渐增强,去除率从50%升高到89%.对2种填料树皮和秸秆上生物膜的分析结果表明,滤池内微生物多样性随运行时间先降后升,从1.6-1.9上升到2以上;而2种填料上微生物的相似性逐渐增加,表明随着驯化进程,生物填料上的微生物能够利用臭气污染物进行生长,并随运行时间逐渐趋于丰富和稳定;树皮比秸秆具有较高的生物多样性,平均值分别为2.2和2.0,说明树皮上容易附着多种微生物生长,电镜照片也显示2种填料生物膜的增长和生物多样性的提高.SSCP条带测序结果表明生物滤池生物膜优势微生物种属为芽孢杆菌属,占33.3%;条带中不可培养细菌占44.4%;填料生物膜上的细菌绝大多数是广泛存在于土壤、水体及生物体中的微生物,它们对环境适应能力强,在臭气的污染物去除中扮演重要角色.