实时定量PCR应用于研讨式分组实验教学实践

实时定量PCR作为一项生命科学及其相关领域的重要技术,已成为高校生物实验教学中不可或缺的知识内容。以分子生物学实验基础教学内容为依托,围绕实时定量PCR技术面向本科生开设了综合性实验。在充分考虑学生的理论和操作水平以及本科实验教学特点的基础上,对实验设计和实验方法进行了优化,并采取研讨式分组教学模式,提高教学效率与教学质量的同时,更突出了学生在实验教学中的主体地位,有助于培养学生的科学思维、科学素养以及综合实践能力。

在生物科学综合实验引入实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术是核酸定量分析的重要方法,是分子生物学领域的前沿技术,广泛应用于基础生物学研究、肿瘤诊断、病毒检测和食品检测等领域。在“生物科学综合实验”课程中引入此项技术,丰富了课程内容,也提高了课程的挑战度。经过教学实践,取得了良好的效果。学生不仅掌握了扎实的实践技能和前沿的科研方法,还提高了数据分析与处理的能力。

Comparison of histopathology and PCR based assay for detection of experimentally induced toxoplasmosis in murine model

Objective:To compare histopathology and PCR based detection in diagnosis of experimentally induced toxoplasmosis of RH human strain of the parasite in murine models.Methods:A comparison of histopathology and PCR based detection was done to diagnose experimentally induced toxoplasmosis in ten inbred swiss albino mice after intraperitoneal inoculation of 100 tachyzoites of laboratory mantained human RH strain of the parasite.Tissue samples from lung,liver,spleen,brain,heart and kidney were taken and processed for histopathological examination while all the samples also were subjected to PCR,using primers directed to the multicopy of SAG 3 gene,in dublicates.Results:Histopathology revealed presence of tachyzoites only in liver while along with lung,liver,spleen and brain tissue yielded desired positive PCR amplicons.Conclusions:The SAG 3 based PCR is able to diagnose toxoplasmosis in those tissues which are declared negative by histopathological assay.

实时荧光PCR技术在高危型人乳头瘤病毒检测中的价值

目的 分析实时荧光PCR技术在高危型人乳头瘤病毒(HPV)检测中的价值。方法 选取本院行病理诊断检查的66例高危型HPV感染者及68例健康女性为研究对象,均实施实时荧光PCR技术和第二代杂交捕获试验(HC-Ⅱ)技术行HPV检测,比较两种检测技术的诊断效能。结果 以病理检验结果为金标准,实时荧光PCR技术的准确度、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、诊断符合率分别为94.03%、96.97%、91.18%、91.43%、96.88%、94.03%,高于HC-Ⅱ技术的76.12%、81.82%、70.59%、72.97%、80.00%、76.12%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 高危型HPV检测中应用实时荧光PCR技术,能够保证疾病检测结果的准确性和可靠性,进而为后续的临床治疗提供支持,应用价值较高。

基于蔬菜核酸检测实验的探究性实验教学设计

以蔬菜中维生素C积累相关基因的检测为例,探索将操作难度相对较高的RNA相关的核酸检测实验应用于本科实验教学中。实践结果表明,学生们可顺利掌握蔬菜中核糖核酸(RNA)的提取、反转录合成互补DNA(cDNA)、PCR扩增检验目的基因表达等RNA相关的实验操作技能,达到了预期的教学目标。本实验项目的实施促进了学生们对多门学科知识的融会贯通,有助于其提高发现问题和解决问题的能力并形成探索精神和创新思维。这对培养具有创新创业实践能力的复合型人才具有重要的作用。

实时荧光定量PCR技术在发育生物学实验

实时荧光定量PCR技术是生命科学研究常用实验技术,发育生物学实验是一门综合性很强的实验课程。为不断完善我院发育生物学实验课程建设,实现培养全面发展人才的教学目标,在本科生发育生物学实验课教学中设计了完整的实时荧光定量PCR实验内容。教学实践结果表明,该实验具有可行性,学生完成情况良好。所设计的实验加深了学生对于基本理论的理解,锻炼了学生的实验技能,激发了学生的学习积极性和创造性,有助于培养学生科学思维以及团队合作精神,获得了良好的教学效果。

PCR技术检测RH株弓形虫组织内感染的实验研究

目的 :建立敏感、特异的聚合酶链反应 (PCR) ,以检测组织内弓形虫感染。方法 :优化PCR反应关键步骤的条件 ,以相同的B1引物扩增相近的病原体判断其特异性 ,扩增倍比稀释的DNA检测其灵敏度 ,并以PCR法检测实验鼠肝、血中DNA的动态变化 ,结果与免疫组化法进行比较 ,评价其检测生物学样本的可行性。结果 :实验建立的PCR技术的灵敏度能达到检测出一个虫体的DNA ,且特异性强 ,不扩增鼠DNA、人DNA、隐孢子虫、卡氏肺孢子虫、鼠疟原虫的DNA。检测实验感染小鼠血、肝脏样本 ,在感染后2天 ,3只鼠血样本PCR结果阳性 ,3只小鼠肝标本2只阳性 ;感染后3天至濒死前所有小鼠检测结果均阳性 ;血样本阳性检出率100 % (11/11) ,肝脏组织样本阳性检出率81.8 % (9/11)。结论 :PCR方法是一种敏感、特异、快速的诊断方法 。

刺梨及其近缘种PCR实验体系的建立与优化

以刺梨及其近缘种月季为试材,进行了RAPD-PCR实验参数的确立和优化试验。结果表明,刺梨及月季25μL反应体系的最优组成为2.5μL10×反应缓冲液,2mmol/LMg2+,0.2mmol/LdNTP,1.6mg/L模板DNA,0.4μmol/L随机引物和1.2UTaqDNA多聚酶。经PCR扩增验证,此反应体系亦适宜于刺梨的部分近缘种,可有效用于RAPD分析;通过将退火温度提高至50℃或采用“Touchdown”扩增程序,并在50μL反应体系中适当增加特异引物对浓度(1.0μmol/L),模板DNA(4.0mg/L)和TaqDNA多聚酶(3.0U/管)的使用量,建立起适合于刺梨特异DNA片段检测及回收的特异PCR扩增实验体系,为刺梨的分子克隆奠定了技术基础。

小鼠肺炎病毒RT-PCR方法的建立及在实验动物感染和国际比对样本检测中的应用

目的建立小鼠肺炎病毒RT-PCR检测方法,用于实验动物及实验动物相关样本的检测。方法选择小鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice,PVM)G基因保守序列设计合成引物,建立RT-PCR方法,并进行方法的特异性、敏感性、重复性和稳定性验证。应用建立的方法对日常送检的27只小鼠、9只大鼠、5只沙鼠肺组织样本和19只PVM感染小鼠肺组织样本,及8份国际实验动物理事会(the International Council for Laboratory Animal Science,ICLAS)国际比对样本进行检测。结果建立的方法与仙台病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、汉坦病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒无交叉反应。能够检测PVM DNA最小模板浓度为8.77×10拷贝/μL,可检测病毒最小滴度为10/mL。用放置-30℃冰箱保存12个月的引物和PVM质粒进行PCR检测,仍能扩增到约249 bp的目的条带。用建立的方法检测日常送检的27只小鼠、9只大鼠、5只沙鼠肺组织样本,结果均为阴性;检测19只PVM感染小鼠肺组织样本,有7只小鼠肺组织样本结果阳性;检测8份ICLAS国际比对样本,有1份样本小鼠肺炎病毒核酸阳性,均符合预期结果。结论建立的PVM RT-PCR方法特异、敏感,重复性、稳定性好,能够用于小鼠、大鼠、沙鼠等实验动物的监测及其相关样本的检测。

木薯SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

【目的】优化木薯SCoT-PCR反应体系并进行SCoT引物筛选,为木薯辅助育种提供技术支持。【方法】以木薯品种新选048为材料,利用正交试验设计对DNA模板量、Mg^(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶量等因素进行优化,确定木薯最佳SCoT-PCR反应体系,并用其进行SCoT引物筛选。【结果】木薯最佳SCoT-PCR反应体系(20.0μL):模板DNA 60 ng,引物浓度0.30μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U,Mg^(2+)1.50 mmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L。利用该体系筛选出19条SCoT引物,能稳定扩增出数量多、清晰可辨且多态性丰富的条带。【结论】优化的木薯SCoT-PCR反应体系检测结果稳定,重复性好,且筛选出的19条引物均适用于木薯遗传多样性分析。

荧光定量PCR仪的边缘效应与实验误差分析

目的:探讨荧光定量PCR分析仪边缘效应及实验误差的原因。方法:通过比较部分国外知名品牌荧光定量PCR仪的光路系统及加热模块设计原理,分析边缘效应及实验误差产生的原因。结果:传统荧光定量PCR仪光路设计缺陷和加热模块的孔间温度均一性不足会导致边缘效应和实验误差,是影响荧光定量PCR结果重复性的重要原因。结论:了解不同品牌荧光定量PCR仪的检测原理,选购性能优良的荧光定量PCR仪,尽量避免实验误差,以保证实验结果的准确性。

PCR技术检测生殖道弓形虫感染的临床实验分析

目的 通过对人类生殖道弓形虫感染状况的检测 ,探讨弓形虫感染与不孕不育的关系 ,以及弓形虫感染生殖道的可能方式。方法 实验设置不孕不育组和正常生育组夫妇 ,用PCR方法检测生殖道分泌物中弓形虫DNA ,把检测结果输入计算机进行SPSS统计学处理 ,分析弓形虫感染的概率。结果 不孕不育组弓形虫感染率为 18 15 % ,而正常生育组为6 2 9% ,P <0 0 1,两组间感染率有显著差异。夫妻之间感染率无显著性差异。结论 弓形虫感染与不孕不育有一定关系 ,夫妻间性行为可能是弓形虫传播的一种途径。

双标准曲线相对定量PCR试验原理与方法

实时荧光定量PCR(FQ-PCR)是一种准确有效的核酸定量分析技术,具有易操作、高通量、高敏感性、高特异性、高度自动化和低污染等优点,并随新定量PCR仪及新操作方法的发展而得到广泛应用,但是,定量PCR的高敏感性特点使得实验操作严格而繁琐。阐述了一种改进的相对定量方法——双标准曲线法的试验原理和特点,描述了定量PCR体系的优化方式,探讨了试验误差分析方法及试验操作技巧,并就试验数据的处理方法进行讨论。试验证明,双标准曲线法是一种经济、简单而准确的定量方法。

免疫PCR的方法学研究进展及临床应用

详细介绍了免疫PCR方法的原理、方法学类型、实验条件控制及临床应用.

《植物组织培养脱毒苗病毒的PCR检测》实验课程开设研究

植物组织培养是现代生物技术的重要组成部分,随着PCR检测技术在生产上的广泛应用,PCR法检测脱毒苗病毒实验课程的建立显得尤其重要。以香蕉试管苗束顶病病毒的PCR检测为例建立了新的实验课程,在实验内容设计、实验方法优化、实验课程安排及实验考核等方面进行了研究和探索。经过3年的有益实践表明,该课程取得了较好的教学效果,提高了大学生的科研能力和植物组织培养应用技能。

应用实时荧光定量PCR方法检测实验用猫巴尔通体的感染

目的建立高效特异的巴尔通体实时荧光定量PCR检测方法,并应用于实验用猫的微生物检测工作中。方法针对NCBI公布的巴尔通体序列设计特异引物和Taq Man探针,使用分子生物学方法制备质粒标准品,建立巴尔通体实时荧光定量PCR方法;对该方法的线性、敏感性、特异性及稳定性进行测定;并使用该方法对142个猫样品进行检测。结果成功建立巴尔通体实时荧光定量PCR方法;该方法线性范围为1.0×101copies/μL^1.0×109copies/μL,相关系数为0.998,检测极限达10 copies/μL;特异性结果显示所建方法具有良好的特异性,并在142份实验用猫样品中检测出阳性样品6份。结论实时荧光定量PCR方法可用于实验用猫巴尔通体的检测工作中。

PCR-DGGE技术分析浸矿体系细菌群落结构的实验优化

为了研究低品位黄铜矿细菌搅拌浸出的浸矿菌液中的细菌群落结构,对PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术相关的实验方法进行了优化,主要涉及低丰度基因组DNA提取方法优化、16S rRNA基因的PCR扩增条件优化以及变性梯度凝胶电泳条件的优化.结果表明,采用分级离心多次浓缩的方法收集矿浆样品中的菌体,再用试剂盒提取基因组DNA,有较好效果;使用含特定"GC夹板"的引物5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3'进行热启动降落PCR,能显著提高目的条带的PCR扩增效率;当DGGE电泳设置温度为60℃左右,胶浓度为6%,尿素变性梯度为30%～50%,恒定电压为100 V,时间为9 h时,可以获得效果较好的DGGE电泳图谱,该优化方案提高了对浸矿体系中细菌群落结构的检测效果.

正交优化多重PCR反应体系检测3种食源性致病菌的研究

[目的]建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的快速、敏感、特异的多重PCR检测方法。[方法]根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的IpaB基因、志贺氏菌的ipaH基因,设计3对特异性引物进行多重PCR检测,利用正交设计对多重PCR反应体系的镁离子、Taq酶、dNTP、引物的浓度在4个水平上进行L16(44)优化试验,并确定该检测方法的特异性与灵敏度。[结果]3对引物能特异性扩增出210、280、393 bp的目的条带。利用FTA滤膜提取模板DNA,采用建立多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度,灵敏度金黄色葡萄球菌为3.5×102cfu/ml、沙门氏菌为2.2×102cfu/ml、志贺氏菌为1.0×102cfu/ml。[结论]该检测方法准确、快速、高效,为同时检测食品中多种致病菌奠定了基础。

野生小果油茶ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立一个具有良好稳定性和可重复性的野生小果油茶ISSR-PCR反应体系,以提取的野生小果油茶总DNA为供试材料,利用单因素试验,正交试验设计L16(45)和方差分析对DNA模板的量,引物浓度,dNTPs浓度,Mg2+浓度,Taq DNA聚合酶的量5个影响ISSR-PCR反应体系的因素进行优化研究。确定野生小果油茶ISSRPCR最优反应体系为:在20μL的反应体系中,DNA模板为30 ng,引物浓度为0.7μmol/L,dNTPs浓度为0.25mmol/L,Mg2+浓度为2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶的量为1.75 U。方差分析结果表明,5个因素对体系的影响均未达到显著水平,其中引物浓度对反应体系影响最大。应用建立的体系对5份野生小果油茶样品进行扩增,证明了该体系具有稳定性和可重复性。

基因工程实验教学中PCR反应条件的正交优化

采用碱裂解法提取大肠杆菌的质粒DNA,检测提取到的DNA浓度和纯度,并以提取的DNA作为PCR反应体系中的模板,采用搜索性正交设计试验法探求PCR反应体系中4个因素(dNTPs、DNA模板、引物和Taq酶)在5个水平上的最适用量,在此基础上,进一步设计细调性正交试验筛选PCR反应的最适条件。结果表明,在20μl PCR反应体系中,DNA模板5 ng/μl,dNTPs 0.25 mmol/L,引物0.6μmol/L,Taq酶1.5 U/μl,Mg2+浓度1.5 mmol/L时,PCR的效果最好。