IHC、FISH、qRT-PCR检测NSCLC ALK融合基因的对比分析

目的对比分析免疫组化(IHC)、荧光原位杂交(FISH)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测非小细胞肺癌(NSCLC)ALK融合基因情况。方法收集453例NSCLC标本。随机选取IHC检测的ALK融合基因不同表达程度标本40例[ALK(-)、(+)、(2+)、(3+)标本各10例],采用FISH和qRT-PCR法分别检测各组ALK融合基因表达水平,并进行一致性分析。结果IHC与FISH、qRT-PCR的ALK融合基因检测结果比较,IHC ALK(-)/(3+)与FISH、qRT-PCR检测结果一致率均为100%,具有高度一致性(r=0.781、r=0.740,P<0.05)。FISH与qRT-PCR的检测结果一致率为97.5%,具有高度一致性(r=0.943,P<0.05)。结论FISH、qRT-PCR法与IHC法检测在不同表达程度ALK融合基因样本中检测结果存在差别,IHC敏感性更高。FISH、qRT-PCR法在ALK融合基因样本的检测结果具有高度一致性。

以长链PCR为基础利用融合PCR扩增乙型脑炎病毒全长cDNA

目的以长链PCR(Long-PCR)技术为基础,应用融合PCR方法扩增乙型脑炎病毒(JEV)全长基因组。方法根据GenBank中收录的JEV全长基因组序列设计引物,分别扩增JEVSA14-14-2株的5′和3′半长分子,在5′端上游引物中引入T7启动子核心序列。利用细胞培养增殖病毒,提取病毒RNA,逆转录后采用Long PCR方法得到JEV的5′和3′两个半长分子,在此基础上进行融合PCR,得到JEV全长cDNA分子,克隆入pGEMT-easy载体,酶切鉴定并测序。结果扩增出均6000bp的JEV的5′和3′两个半长分子及约11000bp的全长cDNA片段,其二级结构丰富的非编码区未发生缺失。JEV全长cDNA分子与GenBank中收录的相关毒株的的核苷酸序列同源性最高达99%,其氨基酸序列同源性最高达96.3%。其E蛋白基因与野毒株和减毒株进行比较,核苷酸序列同源性高达98%～99%,氨基酸序列也未出现较大差异。结论已获得了乙型脑炎病毒SA14-14-2株全长基因组,为进一步构建感染性克隆奠定了基础。

小麦ArfGAP基因的克隆、半定量RT-PCR分析及原核表达

为明确小麦ArfGAP基因在非生物胁迫中所行使的功能,采用电子克隆技术分离普通小麦ArfGAP基因后对其在不同非生物胁迫下的表达特性进行了分析,并在大肠杆菌中表达了该基因。结果表明,从扬麦18号中克隆得到的TaArfGAP基因ORF全长为2 121bp。生物信息学分析表明,TaArfGAP蛋白氨基端方向存在一个典型的ArfGAP蛋白结构域,在亲缘关系上与山羊草、乌拉尔图小麦和短柄草较近,而与甘蓝等作物关系较远。半定量RT-PCR分析表明,TaArfGAP基因在干旱、PEG和NaCl胁迫下显著上调表达,但在高温条件下则显著下调表达。SDS-PAGE检测结果表明,IPTG终浓度为0.8~1.0mmol·L-1、诱导温度为24℃及诱导时间为10h时,在分子量大小为81kD左右可以得到较大的可溶性表达蛋白量,且与预期结果一致,说明TaArfGAP基因在原核表达体系中成功表达。

加入自我延伸过程的融合PCR程序

比较了加入自我延伸过程的融合PCR程序与传统PCR在扩增融合基因的扩增效果,自我延伸程序(94℃×1min,52℃×1min,72℃×1min)扩增2次,分别用不同的延伸时间:1min、2min、3min、5min,发现用2min、3min、5min延伸时间扩增出的融合基因条带比传统PCR显著亮一些,而用延伸时间为1min时,两种程序扩增出融合基因条带的亮度相近,说明自我延伸程序中的延伸时间是影响融合基因扩增量的关键因素。加入自我延伸过程的融合PCR扩增程序为:94℃×5min,(94℃×1min,52℃×1min,72℃×5min)×2次循环,(94℃×1min,52℃×1min,72℃×1min)×30次,4℃store。

三重融合PCR法构建感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆

利用三重融合PCR法,即将3个DNA片段放在同一个反应里进行长片段PCR扩增法,融合得到了包含辛德毕斯病毒XJ-160株结构基因E3、E2、6K、3′UTR和辛德毕斯病毒YN87448株结构基因E1的融合DNA片段E3E26KE13′UTR。通过此融合片段两端引入的XbaI和XhoI酶切位点将其连接到XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆骨架上,成功构建了辛德毕斯病毒株XJ-160与YN87448外膜糖蛋白基因E1相互替换的嵌合病毒cD-NA克隆,命名为pBR-XJ160YE1。该克隆线性化后经体外转录,RNA转录体脂质体法转染BHK-21细胞,36h后细胞发生病变。间接免疫荧光检测到病毒蛋白的表达。提取5次传代后细胞上清中病毒RNA,RT-PCR法检测证明病毒来源于嵌合病毒cDNA克隆。此感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆可以作为研究辛德毕斯病毒E1糖蛋白基因相关功能及XJ-160病毒和YN87448病毒存在单方向血清学反应的分子机理的分子生物学工具。

一种高效构建同源重组DNA片段的方法——融合PCR

融合PCR技术(fusion PCR)采用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸,从而将不同来源的任意DNA片段连接起来,此技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现DNA片段的体外连接,为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。对原有的融合PCR技术进行改进,以3个同源重组线性DNA片段的构建为例,详细论述了改进的融合PCR技术的反应过程及技术体系。结果表明,改进的融合PCR技术可以同时进行3个片段及4个片段的融合反应,产物长度均在4.5kb以上,各同源重组片段在扩增过程中均无突变发生,获得的片段可以用于后续实验分析。

一种载体构建的新方法:重组融合PCR法

本研究介绍一种多目的片段一步重组克隆的载体构建的新方法。该方法要求在PCR引物设计时,在第一个目的片段上游引物的5'端和最后一个目的片段下游引物的5'端各设置16bp与线性化目标载体末端同源的序列,再在各目的片段之间的引物上各设计25bp的重叠序列,以便进行融合PCR将多片段扩增成融合片段。此方法将融合片段与线性化骨架载体进行一步重组、转化和重组子鉴定。该方法只要求骨架载体上有一个特异性酶切位点,特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建;该方法还可以引入定点突变,可便捷构建分析启动子功能等需引入定点突变的载体;该构建方法还可以实现多基因的无缝融合构建多顺反子,在构建原核基因表达载体、叶绿体表达载体、线粒体表达载体方面有着明显优势。本研究以水稻胚乳特异性表达载体PGt1-mGFP-pSB130为例,介绍此载体构建方法。

快速PCR研究进展

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是最常用的分子生物学技术之一,通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增。快速PCR就是基于普通PCR的工作原理,在保证PCR反应特异性、灵敏性和保真度的前提下,在更短时间内完成对核酸分子的扩增。近年来已经开展了许多有关方面的研究工作。以DNA聚合酶的改进、添加剂的选择、热循环仪改进为重点内容,综述快速PCR技术的研究进展。

重叠PCR法构建副猪嗜血杆菌外源打靶基因

利用重叠PCR法构建了包含副猪嗜血杆菌血清5型hhdA基因上、下游同源臂(H-up、H-down)和卡那霉素抗性基因(Kan)的外源打靶基因Hup-kan-Hdown。通过对反应条件进行优化,发现退火温度为50.5℃,加入H-up、H-down和Kan各为5μL(450 ng)时得到Hup-kan-Hdown的量最多。将此外源打靶基因的两端引入PstI和SacI酶切位点,克隆至具有迁移作用的自杀质粒pDS132,构建了可在大肠杆菌E.coliSM10-λpir中稳定遗传的打靶载体,为下一步建立副猪嗜血杆菌的高效基因打靶系统奠定基础。

荧光实时定量逆转录PCR监测急性早幼粒细胞白血病患者的分子学反应

背景与目的:临床及实验研究结果表明,残留白血病细胞与急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者的治疗及复发显著相关。实时定量逆转录PCR(real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,RQ-RT-PCR)可更敏感地检测患者体内的白血病细胞,有利于微小残留病(minimal residual disease,MRD)的监测。本研究应用RQ-RT-PCR方法联合对数级下降分析评估了APL患者的分子学反应,以探讨该方法在MRD监测中的作用。方法:100例初诊APL患者,以全反式维甲酸和复方黄黛片或亚砷酸联合化疗诱导缓解,用RQ-RT-PCR方法特异性扩增和检测PML/RARα融合基因两种异构体的表达量,结果以ABL内参基因标化处理(normalized quotient,NQ)。动态观察其中33例患者融合基因转录本的表达水平,对数级下降分析法监测分子学反应,最后以SAS8.0软件进行统计学处理。结果:100例初诊APL患者中位NQ为0.58,其中L型转录本NQ为0.52,S型转录本NQ为0.74,两者比较差异无统计学意义。动态观察发现33例患者在初诊、诱导达完全血液学缓解时、巩固化疗后及维持期,NQ分别从0.62下降到0.25,再降到0.0003,最终降至0。联合对数级下降分析法,患者治疗后各期的分子反应率从次要分子学反应的63.64%,到部分分子学反应的96.97%,再到主要分子学反应的100%。结论:RQ-RT-PCR联合对数下降分析法可用于APL患者的MRD监测,结果直观、可靠,并且与临床患者的分子学反应密切相关。

实时定量逆转录PCR在白血病标志物检测中的应用

目的 建立实时定量逆转录PCR（RQ-RT-PCR）检测各种急慢性白血病的特征性分子生物学标志物,评价其在疾病诊断和微小残留病（MRD）监测中的意义.方法 设计TaqMan探针和引物,建立RQ-RT-PCR法对各种融合基因转录本和ABL阳性模板进行扩增,并检测177份白血病标本的转录本含量,同时做细胞遗传学检查.结果 RQ-RT-PCR法最低可检测到10个拷贝/μl的阳性模板,但重复性较差,而（10^8～10^2）拷贝/μl的重复性良好,正常对照无扩增信号.与细胞遗传学相比,RQRT-PCR的敏感性和特异性更强,对白血病标志物的阳性检出率更高.对12例不同类型白血病患者的MRD随访监测表明：患者体内融合基因转录本的含量随病情进展逐渐升高,随病情好转逐渐下降,并且早于细胞遗传学预测疾病复发.结论 RQ-RT-PCR方法更敏感、可靠,与疾病的关系更密切,可用于白血病的诊断和MRD随访.

两步融合PCR法构建烟曲霉ssk1基因敲除株

目的通过两步融合PCR法构建烟曲霉ssk1基因敲除株。方法通过在ssk1基因上下游的侧翼序列设计引物时引入15 bp的融合片段的互补的同源区,使用两步融合PCR的方法将长度约为4.3 kb的目的片段融合扩增,并直接使用PCR产物通过传统的原生质体法进行烟曲霉的转化,得到转化子运用PCR和Southern blot进行相应的验证。结果通过融合PCR法较快的得到大约4.3 kb的融合的目的基因片段,运用原生质体法成功进行了烟曲霉的转化,得到5个转化子。经过PCR和Southern blot经验证有4株是正确的转化子。结论在合适的引物设计及适当的融合PCR反应条件下,两步融合PCR法是一种简单高效的构建烟曲霉基因敲除株的方法,值得推广。

实时定量RT-PCR检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的临床意义

目的:建立实时定量RTPCR方法检测慢性粒细胞白血病(CML)bcr/ablmRNA的方法;探讨CMLbcr/abl融合基因的表达水平与疗效的关系。方法:可同时检测b2a2和b3a2两种亚型,GAPDH的mRNA作为内参照。检测14例CML患者的22个外周血和骨髓样本中bcr/abl融合基因表达水平,并对2例异基因造血干细胞移植后复发的患者进行动态监测。结果:bcr/abl及GAPDH标准曲线的相关系数均为0.999;灵敏度为10-6;14例初诊患者的mRNA表达水平范围为2.81～145;2例异基因造血干细胞移植后复发患者的bcr/ablmRNA表达水平随临床治疗而变化。结论:实时定量PCR检测CML患者的bcr/abl融合基因,敏感可靠,重复性好;其融合基因表达水平的改变与临床疾病进展关系相一致,有助于反映白血病细胞负荷、评价疗效及判断疾病预后。

降落-重叠PCR法四重融合构建平菇同源重组片段

对多个长片段的基因融合目前仍缺少有效的方法.本文提出一种新的融合PCR策略,即在常规的重叠PCR的第1步和第2步均增加1个降落PCR程序,减少不适当的退火温度和PCR产物3'端额外碱基A对片段融合、扩增的影响,提高正确融合与扩增的效率.结果表明,为构建平菇葡聚糖合成酶启动子的同源重组序列,在4个长度分别是1 015 bp、2 822 bp、2 206 bp和1 008 bp的片段进行融合时,在重叠PCR的第1步加上退火温度61.5℃～57.5℃、每降落0.5℃进行1个循环的降落PCR程序,在重叠PCR的第2步加上退火温度60℃～56℃、每降落0.5℃进行1个循环的降落PCR程序,经过1次PCR即获得顺序正确的全长融合片段.测序结果与4个片段序列的一致性达到98.5%,降落-重叠PCR法对多个长片段的基因融合具有较高的应用价值.

应用实时荧光定量RT-PCR检测急性髓系白血病患者aml1／eto融合基因的临床意义分析

本研究目的旨在构建实时荧光定量RT-PCR(RQ-RT-PCR)方法检测用的am l1/eto融合基因的RNA标准品,并以此作为工具监测急性髓系白血病M2患者微小残留病(MRD)的状态。应用定性的RT-PCR筛选患者标本中的am l1/eto融合基因,经体外扩增转录,得到1010拷贝数RNA标准品,并对37例患者骨髓/外周血标本进行了检测。结果表明:构建的RNA标准品具有线形良好的标准曲线,扩增效率较高,特异性较好;患者初诊组和复发组的目的基因am l1/eto的相对值的平均值高于完全缓解组(CR)(p<0.05);随访的患者中初诊时目的基因am l1/eto的相对值很高,完全缓解时降低,复发时明显升高。初诊和CR两个时间点目的基因am l1/eto的相对值相差2个数量级以上时,病人的复发危险性相对较小,如果am l1/eto基因的相对值持续升高,则提示患者的预后较差。结论:RQ-RT-PCR方法检测am l1/eto融合基因的敏感性和特异性比较高,可信度和稳定性较好;对am l1/eto融合基因阳性患者MRD定量动态监测有助于初步评价治疗效果,估计患者的复发危险度,因此有望成为确定强化治疗的时机、延长病人完全缓解期的重要手段。

实时定量RTPCR监测儿童AML患者AML1/ETO融合基因的临床价值

为了探讨实时定量RT PCR(real timeRT PCR)监测儿童AML患者AML1 ETO融合基因的临床价值 ,筛选出AML1 ETO阳性患儿 14例 ,以连续稀释的AML1 ETO质粒作为标准品建立标准曲线 ,应用实时定量RT PCR监测其初治及随访期 5 8份骨髓中AML1 ETO融合基因 ,用SPSS软件进行统计学分析研究其和临床的关系。结果显示 :实时定量RT PCR监测AML1 ETO基因的敏感度可达 10 - 5,重复性好。 12份初治标本的AML1 ETO∶GAPDH比值平均为 0 .6 4 8,该比值与骨髓中幼稚细胞数的比值无相关性。微小残留白血病 (MRD)定量水平检测发现 ,化疗 1个月时 6例患儿AML1 ETO的量无明显下降 (高于 5× 10 - 2 ) ,其中 3例早期复发 ,1例晚期复发 ;另 4例患儿有明显下降 (低于 10 - 2 ) ,均长期存活。化疗 3个月时 5例高于 5× 10 - 3者中 3例复发 ;另 6例低于 5× 10 - 3者中 1例复发。 6个月后持续高于 10 - 3者 3例均复发。MRD定量水平动态检测发现 ,在化疗中MRD持续在高水平 (>5× 10 - 3)者 4例全部临床复发 ,复发时间在 3个月到半年 ;4例持续低于 10 - 3,维持在 10 - 4- 10 - 6 ,一直处于骨髓缓解期 ;1例化疗中从 10 - 5上升到 10 - 3,5个月后临床复发。 3例持续缓解超过 9个月的患儿仍可检测到融合基因 ,约 10 - 5- 10 - 6 。结论 :实时?

PCR构建融合基因方法的建立

以聚合酶链式反应为基础的片段拼接技术——融合PCR技术是一种新的基因片段融合技术。以含有马铃薯块茎两种淀粉合成关键酶ssⅡ和ssⅢ基因为模板,利用融合PCR对其进行融合拼接,初步建立以PCR产物(不回收)及一步PCR法融合基因的构建方法,并对融合基因构建时PCR产物(不回收)的使用量及一步PCR法构建融合基因的中间引物浓度等条件进行优化。结果表明,以不回收的PCR产物为模板构建融合基因时PCR产物(不回收)的使用量在10-20 ng范围内为佳;一步PCR法构建融合基因的中间引物浓度在25-1 000 nmol/L为宜。

多重RT-PCR检测儿童急性淋巴细胞白血病融合基因的临床意义

目的探讨儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)染色体畸变所形成的融合基因与MICM分型及临床诊断、治疗、预后的关系。方法采用多重巢式RT-PCR方法联合染色体核型、免疫表型、临床患儿资料对53例儿童ALL进行研究。结果53例儿童ALL中18例(33·96%)具有11种克隆性基因重排,包括SIL/TAL1D、E2A/PBX1、TEL/AML1、MLLex7/AF9、MLLex8/AF9、MLLex8/AF10、MLLex8/AFX、MLLex9/AF6、MLLex9/ELL、MLLex7/AF4及TLS/ERG。9例患儿有HOX11原癌基因活化。TEL/AML1表达者预后良好;B-ALL合并HOX11活化近期疗效好;T-ALL合并HOX11预后不良;有MLL基因重排的预后极差。结论采用多重RT-PCR方法可快速同时检测儿童急性白血病29染色体畸变所形成的融合基因,完善白血病的MICM分型及指导临床个体化治疗。

不典型慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的RT-PCR研究

应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对30例慢性粒细胞白血病(CML)患者的bcr-abl融合基因进行了检测,并结合临床、血液学、细胞化学和细胞遗传学等指标对4例Ph^-CML进行了分析,其中的1例t(7;22)(q22,q24)易位为国内外首次报道。结果表明,Ph^-/bcr^+CML和具有变异型Ph染色体的CML与Ph^+CML之间有较多相近之处,如白细胞与血小板数较多,N-ALP较低,脾肿大明显,发病年龄较轻,易发生急变;Ph^-/bcr^-CML与Ph^+CML之间差异显著,如发病年龄较高,脾中度肿大,白细胞数多者较少,急变较少见。

应用多重RT-PCR结合寡核苷酸芯片方法检测儿童白血病常见融合基因

本研究探讨基因芯片在儿童白血病8种常见融合基因检测中的应用。采用多重巢式RT-PCR结合寡核苷酸芯片方法对84例临床收集的白血病标本进行融合基因检测。结果表明:此芯片可以从患者骨髓样本RNA中准确检测到阳性参照序列以及与融合基因相对应的特异基因片段。84例白血病患者骨髓标本中,31例(36.90%)具有8种染色体结构畸变产生的融合基因。包括tel/aml1、e2a/pbx1、bcr/ablp190、bcr/ablp210、mll/af4、aml1/eto、pml/rarα、cbfβ/myh11。芯片检测的敏感性及特异性和RT-PCR方法相当。结论:采用多重巢式RT-PCR结合寡聚核苷酸芯片方法,可快速并同时筛选出8种染色体结构畸变产生的融合基因,为儿童白血病危险分层、治疗选择、预后判断提供重要依据。此种方法应用于筛查初治白血病儿童融合基因表达时优缺点并存,具有一定临床实用价值。