Quantitation of PCR Products by Capillary Electrophoresis in a Single Run

A simple method was developed to quantify DNA fragments such as PCR (polymerase chain reaction) products by capillary electrophoresis. Restraint fragments with different lengths were employed as internal standards in the study, which makes it possible for the evaluation of the quantity of PCR product in a single run.

病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测方法的建立

为建立病毒性出血性败血症病毒精准快速检测方法,以病毒性出血性败血症病毒基因组特异保守的糖蛋白基因片段为靶目标,设计合成了特异性引物及探针,优化退火温度等关键反应条件,分别进行灵敏性试验、特异性试验及重现性试验,构建病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测技术体系,同时,与实时荧光定量RT-PCR方法进行对比分析。试验结果显示,病毒性出血性败血症病毒数字PCR最佳退火温度为58.5℃。灵敏性试验显示,随着病毒性出血性败血症病毒基因组RNA连续10倍稀释,稀释至105倍数时,数字PCR体系仍可以检测到阳性微滴,因此,确定RNA基因组核酸含量19拷贝/μL为病毒性出血性败血症病毒数字PCR的检测低限。特异性试验表明,该方法只与目标病毒——病毒性出血性败血症病毒有特异性扩增,与传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、流行性造血器官坏死病毒、牙鲆弹状病毒、病毒性神经坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、真鲷虹彩病毒、淋巴囊肿病毒等10种病毒均无扩增反应。重复性试验结果表明,病毒性出血性败血症病毒数字PCR批内与批间试验的变异系数均小于1%,具备良好的重复性。利用构建的数字PCR方法,对收集到的国内及进境鱼类样品共计1210批次进行病毒性出血性败血症病毒检测,结果显示,数字PCR阳性样本检出率为9.5%,常规实时荧光定量RT-PCR阳性样本检出率为7.69%~7.77%。临床试验结果表明,研究建立的病毒性出血性败血症病毒数字PCR方法较常规技术具有更高的检测灵敏性,适用于水生动物疫病精准检测的需求。

11种肉及肉制品动物源性成分PCR检测技术

为建立准确的动物源肉制品检测技术,采用生物信息学方法,针对猪、牛、马、山羊、小鼠、大鼠、兔、犬、鸡、鸭、鹅等11种动物肉类的特异性基因,建立了特异性PCR检测技术。该技术可高特异性检测猪、牛、马、山羊、兔、犬、鸡、鸭、鹅源肉样,并可鉴别掺入的大鼠、小鼠等违禁肉类成份,最低检测限为1.00 ng/μL基因组DNA,以及低至1%的肉类添加量。运用该技术在市场中随机抽检3种初加工肉制品各10份进行验证,结果在每种肉制品中均检出掺假样品,不同种类肉品的掺假率为10%~20%。本研究建立了具有高灵敏、准确、低成本、适用范围广等优势的肉制品动物源性成份检测技术,为消费市场肉制品质量检测提供了技术支撑。

PCR产品色彩的可持续性与用户感受实验

文章旨在通过采用文献查阅、词频分析、问卷调查、专家访谈、案例分析、实验验证的研究方法,分析用户认为的具有可持续感、环保感的使用后回收塑料--PCR(Post Customer Recycled)材料产品的设计色彩。首先通过词频分析的方法,发现灰色、绿色、蓝色的产品外观更符合用户对环保色彩的认知。其次通过问卷调查的方法,发现设计类学生认为“环保”“可持续”的产品应该具有“绿色”“简洁”“粗糙”“轻/软”“朴素”等特征。之后通过专家访谈的方法对已有内容进行补充,通过总结,得出更符合消费者认知的可持续产品的色彩与感受营造方案。最后通过案例分析与实验验证的方法得出色彩样板并且证明PCR材料色彩可持续性的有效性,使之从颜色和肌理的美感中体现环保的概念。

荧光定量PCR方法检测头孢类产品中的残留DNA

目的荧光实时定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RTFQ-PCR)检测头孢类产品中残留DNA方法开发、验证及应用。方法采用柱式游离DNA抽提试剂盒(离心柱法)提取供试品中残留DNA;将已知浓度的产黄枝顶孢霉基因组DNA标准溶液系列稀释后,根据DNA标准溶液的循环阈值与浓度之间的线性关系,对5种头孢类产品中的残留DNA进行定量分析;对方法进行专属性、线性和范围、准确度、精密度验证,并使用该方法对5种头孢类产品进行残留DNA检测。结果DNA标准溶液的线性范围为10 fg/μL~1 ng/μL、相关系数R^(2)>0.99、扩增效率为90%~110%、LOD相当于83 pg/g,质控样品回收率为50%~150%,供试品相对标准偏差(RSD)均小于30%,方法学验证的各项参数均符合规定。结论离心柱法结合qPCR探针法能够简便、快速、准确地对5种头孢类抗生素中的残留DNA进行定量测定,方法的专属性、线性、准确度、精密度等各项指标均可达到方法验证的要求,适用于头孢类产品中残留DNA的检测,对其他发酵或半合成抗生素的质量控制具有借鉴意义。

琼脂糖粉的质量对PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳的影响

目的:研究琼脂糖粉的质量对聚合酶链式反应(PCR)产物琼脂糖凝胶电泳的影响。方法:PCR产物琼脂糖凝胶电泳中分别使用不同牌子的琼脂糖粉,同时跑胶图像。结果:质量差的琼脂糖粉电泳结果有明显弥散现象,而更换高质量的琼脂糖粉,未见弥散现象。结论:琼脂糖粉质量在分子生物学PCR产物琼脂糖凝胶电泳实验中扮演重要角色,使用高质量的琼脂糖粉对实验的成功至关重要。

基于便携式荧光定量PCR仪定量检测驴肉中掺假鸭肉

为建立快速方便的驴肉制品分子鉴定方法,本文以驴肉和常见的掺假肉类(鸭肉)为研究对象,筛选特异性引物和TaqMan探针,利用便携式Mini8 Plus实时荧光定量PCR仪进行灵敏度和特异性实验,通过绘制扩增标准曲线及确定驴肉和鸭肉的质量与DNA比值常数,对不同掺入比例(加入定量的鸭肉制成含量分别为20%、40%、60%、80%)的模拟样品和实际驴肉样品进行检测。结果显示,该方法对驴、鸭肉均具有良好的特异性,可以与马、猪、山羊、梅花鹿、牛、鸡、狗肉明显区分;对驴源性DNA成分的检出限为0.01 ng/μL,鸭源性DNA成分的检出限为0.1 ng/μL,对驴肉与鸭肉混合物中鸭肉成分的灵敏度为0.1%(w/w);所建立的标准曲线线性关系良好,驴肉DNA扩增标准曲线:y=-3.584x+27.003,R^(2)=0.9982;鸭肉DNA扩增标准曲线:y=-3.538x+30.907,R^(2)=0.9991;采用已建立的方法对35份驴肉样本进行市场试点调查,发现6份(17.1%)驴肉样本中含有鸭肉成分。以上研究结果说明,该实时荧光定量PCR方法可用于驴肉产品中其他掺假肉类(鸭)的快速、准确检测,为驴肉及其制品的市场监管和相关执法提供有力的技术保障。

花生制品中金黄色葡萄球菌SYBR Green qPCR快检方法的评价研究

金黄色葡萄球菌是花生及其制品中常见的一种食源性致病菌,针对金黄色葡萄球菌的快速检测方法对实现花生及其制品中的食品安全防控有重要意义.根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)设计了3对特异性引物,同时优化了退火温度,成功建立了一种特异性引物的SYBR Green实时荧光定量PCR(qPCR)快速检测方法,进一步对该方法的特异性、重现性及灵敏度进行了验证.以8种模拟污染花生加工产品为实验对象,对该方法与荧光定量PCR试剂盒-探针法及商品化Baird-Parker干粉培养基法进行了评价研究.结果表明,建立的SYBR Green qPCR快速检测方法特异性和重现性良好,最低检测限为8.99 copies/μL,其灵敏度比荧光定量PCR试剂盒-探针法高2个数量级.SYBR Green qPCR快速检测方法具有成本低、检测快速、特异性好、灵敏度高的优点,可用于花生及其制品中金黄色葡萄球菌的快速检测,也可为防控其他食品中的金黄色葡萄球菌污染提供参考.

Comparison of Two Real-time PCR Technigues for Quantification of GMO Contents in Highly Processed Products of Soybean

The RR soybean was quantitatively detected by ABI Prism 7300 sequence detector with PCR primers and fluorescence probes were designed according to the sequences of endogenous Lectin gene and exogenous CP4-EPSPS gene, and the PCR systems were based on SYBR Green I and TaqMan. The standard curve of ACt between CP4-EPSPS gene and Lectin gene of the RR soybean in standard materials was generated and a linear regression equation was obtained. Quantification methods were optimized through two different real-time PCR chemistries, i.e. SYBR Green I and TaqMan, and the RR soybean contents were quantified in five standard samples and seven highly processed products by the two assays. Both methods are proved to be specific, highly sensitive and reliable for both identification and quantification of soybean DNA. The results indicate that the two optimized PCR system can be used for the practical quantitative detection of RR soybean in highly processed products.

实时荧光定量PCR检测肉制品中牛源性成分及其含量

建立一种快速、高效、准确且低成本的肉制品中牛源性成分鉴定及量化检测方法。以细胞核单拷贝基因bosPDE为目的基因,LcoR为内参基因分别合成引物及探针,优化反应条件,评价该方法的特异性和灵敏度。采用实时荧光PCR相对定量法,以△Ct值与2^(△△Ct)值线性模型分别建立回归曲线,通过人工模拟混合牛肉样品对方法准确性评估。结果表明:目的基因bosPDE引物仅对牛肉DNA进行扩增,具有特异性,对牛肉DNA扩增的灵敏度可达0.01 ng·μL^(-1)。以△Ct值与2^(△△Ct)值为定量指标的回归曲线分别为y=-3.096 5x+8.479 7(R~2=0.998)、y=0.712 2x+3.050 4(R~2=0.988 7)。两个方法检测35%~90%牛肉含量的人工模拟混合牛肉样品的回收率为分别为94.30%~102.52%、98.55%~106.30%。将两种定量方法进行数均处理,回收率的偏差减少。本研究建立的实时荧光定量PCR方法能够准确对肉制品中的牛源性成分进行定性,并可用于牛肉掺伪制品中的牛肉相对定量分析,对鉴别肉制品掺假以及量化牛肉制品成分含量具有重要参考价值。

一种PCR产物克隆的新方法——T-A克隆法

介绍一种ＰＣＲ产物克隆的新方法———ＴＡ克隆法．用改良碱裂解法抽提ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）质粒，用ＥｃｏＲⅤ将ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）质粒切成平端，利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶及ｄＴＴＰ制备ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ＴＡ载体．将βａｃｔｉｎｃＤＮＡ片段克隆入自制的ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ＴＡ载体，经ＥｃｏＲⅠ及ＨｉｎｄⅢ双酶切得到与设定长度一致的βａｃｔｉｎｃＤＮＡ片段．

一种简便高效的改良降落PCR

降落 (touchdown ,TD)PCR通常涉及 1 5个退火温度 ,程序设计复杂。报道了一种简便高效的改良降落PCR ,只需 5个降落退火温度 ,以杜氏盐藻 (Dunaliellabardawil)基因组为模板 ,设计一对引物扩增胡萝卜素生物合成相关 (carotenebiosynthesisrelated ,cbr)基因的第 3外显子。实验证实该方法程序简单 ,比标准降落PCR步骤简化 70 % ,且产物的特异性及效率都有较大提高。

烟草环斑病毒PCR产物的克隆及部分序列分析

将ＴＲＳＶ的ＰＣＲ产物与ｐＧＥＴ－ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ连接，克隆到大肠杆菌ＴＧ１中，得到白色菌落，重组质粒通过酶切鉴定、ＰＣＲ扩增和部分序列分析，表明ＴＲＳＶ的ＰＣＲ产物确实插入了质粒，并已克隆到大肠杆菌中，测序列２４０个碱基，与资料显示的序列相比较，同源性达９２．５％，可用于解决病毒检疫应用中阳性对照有扩散危险的疑难问题。

中国6个地方猪种与3个外种猪氟烷基因PCR产物序列比较研究

本文应用PCR方法 ,体外扩增了中国地方猪和外种猪共 16个个体的氟烷基因 1814 9～ 1876 0位之间 6 12bp的片段 (包含完整的外显子 17和cDNAC1843 →T1843 突变位点 ) ,并进行了序列测定。结合网上下载的 5个中外猪种相同区段的序列进行了比较研究。结果表明 ,本文所测序列比网上公布的序列少 2bp ,在 1815 3,1815 4处有两胞嘧啶(C)缺失 ;皮特兰猪在cDNA的C1843 位点存在C1843 →T1843 突变 ;6 12bp的片段中共有 14个变异位点 ,皆为转换型突变 ,内含子 16中有 3个位点存在转换型杂合子 ;所有突变中 ,有 4处发生在外显子 17内 ,除香猪和皮特兰猪外均为同义突变 ;这些变异位点共形成 12种单倍型 ,其中扩增片段 5 14位 (全序列中为 186 6 2位 )的C→T突变为内江猪独有 ,构成了内江猪独特的单倍型 ,C18662 →T18662

PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌

目的利用PCR技术,无需增菌,直接检测乳品中的金黄色葡萄球菌。方法通过溶剂提取的方法从人工样品中提取模板,以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)为靶基因,经过PCR扩增得到279bp的产物。经过DNA测序证实该产物为目的扩增产物。采用PCR方法实际检测了乳品中的金黄色葡萄球菌,同时,与国标GB4789.10—94方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌测试片PetrifilmRSA.CountPlate及Baird-parker+RPFAgar进行了比较。结果PCR方法的灵敏度高,全脂乳和脱脂乳检测的检出限为10CFU/ml,奶酪检测的检出限为55CFU/g,可在6h内完成对乳品中金黄色葡萄球菌的检测,比目前普遍采用的先增菌再进行PCR检测的方法缩短了12～24h。与国标方法相比,PCR方法的符合率为94.3%,敏感性为100%。结论采用溶剂提取制备模板的方法可有效的用于PCR直接检测(无需增菌)乳及乳制品中的金黄色葡萄球菌。

转基因定量检测量值转换系数的研究进展

基于PCR技术测定的转基因成分定量结果主要是拷贝数比值,而“产品标识”规定检测结果必须以质量分数表示。量值单位的不统一,造成无法根据检测结果直接进行标识与否的判定。因此亟须研究转基因含量2种单位间的量值关系,建立实现量值转换的“转换系数”定值方法,从而保障检测结果与标识阈值的直接可比。通过对国际转基因“产品标识”制度进行总结,系统分析了影响“转换系数”量值的关键因素和欧盟建立的定值方法,并就我国开展相关研究的重要性进行了论述,为我国转基因“产品标识”制度的有效执行提供参考。

PCR产物直接测序技术中影响因素的研究

探讨了PCR产物直接测序技术中的影响因素,结果表明:PCR产物特异性是影响其测序成败的关键因素,PCR反应只有产生惟一扩增产物时,其产物才能被用来直接测序;PCR反应体系残留混合物（dNTP、引物和盐离子等）对其测序质量有明显不利影响,PCR产物纯化后其测序质量能明显提高;同时,PCR产物大小不同,其测序反应的模板用量也不同,在一定长度范围内,最适模板用量随PCR产物长度增加而增加。

双重PCR-毛细管电泳法快速检测大豆中转基因成分

目的 建立抗草甘膦转基因大豆的快速检测方法。方法 针对转基因大豆基因组中被导入的 35 S启动子、NOS终止子和 CP4 - EPSPS抗草甘膦基因等外源基因 ,自行设计了两对引物 ,采用双重 PCR同时扩增上述基因 ,用 8g/L羟丙基甲基纤维素为筛分介质 ,在 5 0 cm× 10 0μm i.d.涂壁毛细管中 ,于 - 10 k V电压下用激光诱导荧光 -毛细管电泳检测转基因大豆的 PCR扩增产物。结果 在优化的 PCR反应和毛细管电泳条件下 ,本法可以同时检测出转基因大豆样品中三种外源基因 ,双重 PCR扩增产物经测序证实与原基因序列完全一致 ,表明本研究设计的引物合理 ,扩增结果可靠。毛细管电泳进样量仅需 5 nl,分析时间为 2 4 min,迁移时间的相对标准偏差≤ 3.2 %。结论 本方法较常规琼脂糖凝胶电泳特异性高 ,分析时间短 ,重现性好 ,检测灵敏 。

果树基因组DNA的提取和PCR扩增测序方法

为避免多年生果树组织中的多糖和酚类物质影响基因组DNA的提取质量,在CTAB提取缓冲液中加入2%PVP-40和2%β-巯基乙醇,以改进的CTAB提取方法从苹果嫩叶中提取基因组DNA。所得DNA样品D_(260nm)/D_(280nm)比值为1.98～2.05,纯度高。当用DNA样品和设计的特异引物进行PCR扩增时,其PCR产物只出现一条清晰电泳谱带,质量满足测序要求,采用DNA纯化试剂盒纯化后可直接用于测序。该方法已成功用于"国光"和"金冠"苹果的基因组DNA测序,是一个操作简便、快捷和高效的方法,非常适用于果树基因组DNA的提取和测序。

桃SSR-PCR主要因子对扩增产物的影响

以寿星桃为试材，通过Mg^2＋和DNA聚合酶、模板DNA和引物用量的两个双因素试验，以及dNTP用量的单因素试验，研究了5个主要因子对SSR扩增结果的影响，并对桃SSR反应体系进行了优化。结果表明，Mg^2＋和DNA聚合酶的用量对SSR扩增结果起着关键作用，且两者之间存在明显的可作效应；dNTP用量也对SSR的扩增结果起着重要作用，当浓度在200～300μmol／L时效果较好；模板DNA与引物用量之阃没有很明显的互作效应，适当增加引物用量可以提高SSR的正确扩增；优化的桃SSR反应体系为：25μl的总反应体积中含1×PCR Buffe、Mg^2＋ 3mmol／L、DNA聚合酶1．5U、SSR引物各0．4μmol／L、模板DNA 50ng、dNTP 200 μmol／L。