Gentier96全自动医用PCR分析系统检测HBV-DNA及HCV-RNA的性能验证

目的 对实验室新购入设备Gentier96全自动医用PCR分析系统使用HBV-DNA及HCV-RNA定量检测项目进行性能验证。方法 通过检测HBV-DNA及HCV-RNA定量检测项目,对精密度、正确度、线性范围及抗干扰能力进行验证和评价。结果 该系统检测低水平和高水平HBV-DNA的实验室变异系数(CV)分别为4.12%、1.27%。低水平和高水平HCV-RNA的实验室变异系数(CV)分别为4.75%、1.46%。HBV-DNA国家标准物质GBW(E)090137(浓度编号S5)靶值的对数值3.15、GBW(E)090139(浓度编号S2)靶值的对数值6.66。HCV-RNA国家标准物质GBW(E)090140(浓度编号S5)靶值的对数值3.34、GBW(E)090142(浓度编号S3)靶值的对数值5.64,实测值与靶值的差异均在±0.4对数值范围内。该分析系统HBV-DNA定量检测在4.69×10~2.04×109范围内呈线性,线性回归方程为Y=0.9884X+0.1452,R2=0.9994。HCV-RNA定量检测在3.47×10~2.33×107范围内呈线性,线性回归方程为Y=0.9548X+0.3302,R2=0.9997。干扰物质血红蛋白(Hb)样本与对照组样本偏倚<±7.5%,表明常见抗干扰物质血红蛋白(Hb)浓度≤2g/dL时对HBV-DNA和HCV-RNA定量检测结果无影响。结论 Gentier96全自动医用PCR分析系统检测HBV-DNA及HCV-RNA已达到相关标准要求,可用于样本检测。

用分级定量RT—PCR测定中国人血清中HCV RNA

目的 利用分级定量方法建立分级测定血清中HCV RNA含量的定量方法。方法 设立3个DNA标准竞争模板(10^2cop，10^4cop，10^6cop)分别和恒量的待测RNA模板cDNA共同进行PCR扩增，最后用凝胶电泳分离待测模板和竞争模板的PCR产物，测定两者的荧光强度比值，计算待测RNA的模板初始量。结果 该方法灵敏度为1×10^1cop，对丙型肝炎患者血清HCV RNA定量，结果表明，10份HCV RNA阳性血清中，HCV RNA的血清浓度在3×10^5～6×10^8cop·L^-1之间。结论 该方法可用于HCV RNA以及其他RNA病毒的RNA定量。

不同浓度HBV DNA和HIV-1 RNA对多重PCR检测HCV RNA的干扰验证分析

目的探讨多重聚合酶链式反应(PCR)技术在献血者血液标本中不同浓度HBV DNA和(或)HIV-1 RNA对低浓度HCV RNA检测结果的影响。方法采用阴性血浆对HCV RNA标准物质、已定量的HBV DNA和HIV-1 RNA血浆进行稀释,配制成2种病毒或3种病毒的混合液,HCV RNA浓度稳定在20.4 IU/mL[该PCR检测系统95%平均检测下限(LoD)的3倍],HBV DNA浓度为20 IU/mL、200 IU/mL、2000 IU/mL和(或)HIV-1 RNA浓度为50 copies/mL、500 copies/mL、5000 copies/mL的混合液,同时设置对照组(只有3×LoD的HCV RNA溶液),模拟献血者血液样本,分别在Roche Cobas s201核酸检测系统进行单检模式和混样模式(与5个阴性标本混合)至少检测20次,统计分析不同浓度病毒核酸检测Ct值差异以及单检模式与混检模式的漏检率。结果不同浓度HIV-1 RNA和(或)HBV DNA在单检模式下对HCV RNA检测的Ct值差异无统计学意义(P>0.05);HCV RNA在单检模式下的Ct值中位数36.60(36.20,37.10)明显低于混检模式的Ct值39.30(38.60,40.00)(P<0.05),10个分组中HCV RNA在单检模式的漏检率均为0%,而在混检模式的平均漏检率为12.62%,差异有统计学意义(P<0.05);此外,浓度20 IU/mL的HBV DNA进行单检的漏检率为7.55%,进行混检的漏检率为81.4%;50 copies/mL的HIV-1 RNA和20.4 IU/mL的HCV RNA在单检时漏检率为0%,而混检漏检率分别为28.57%和12.62%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论不同浓度HBV DNA和HIV-1 RNA对多重PCR检测HCV RNA结果无影响,但弱阳性HCV RNA、HBV DNA和HIV-1 RNA标本在单检模式下的漏检率低于混检模式,为提高血液安全,血液核酸检测应尽可能采用单检模式。

荧光定量PCR检测HCV-RNA和ELISA检测抗-HCV的比较

目的分析血站开展HCVRNA检测的必要性。方法对48份抗-HCV阳性标本(s/co≥1)、19份抗-HCV灰区可疑标本(0.8≤s/co<1)及1000份抗-HCV阴性标本(s/co<0.8)进行FQ-PCR检测。结果三类标本HCVRNA阳性数分别为30例、5例、2例。结论在ELISA检测抗-HCV基础上加做HCVRNA核酸检测,有助于保证输血安全。

HCV RNA RT-PCR测定室间质量评价的研究

目的 建立国内HCVRNART PCR测定的室间质量评价系统。方法 室间质量评价研究工作采用的质控血清盘由 10支冻干质控血清组成 ,其中包括 2份强阳性、 2份弱阳性、 2份阴性和一个 5倍倍比稀释系列 (4份 )。将血清盘寄发给各参评实验室并要求各个实验室按照规定时间检测、回报结果 ,然后对结果进行统计分析。结果 多数参评实验室存在不同程度的假阳性和假阴性的问题。 2份强阳性标本检出率均为 87 5 % ,弱阳性标本 (含量分别为 6 76× 10 4 和 3 81× 10 4 拷贝数 /ml)检出率分别为 45 83%和 2 5 0 0 % ;阴性样本的假阳性率分别为 12 5 0 %和 16 6 7% ,2份阴性标本测定均正确 37家 ,占77 0 8% ;稀释系列测定正确的有 16家实验室 ,占 33 33 % ,仅 2家实验室稀释系列测定完全正确 ,5家实验室既存在假阴性又存在假阳性问题。结论 许多临床实验室虽然建立了PCR检测方法 ,但却存在特异性和灵敏度问题 ,有必要定期进行室间质量评价 ,保证该项目的检测质量。

检测HCV RNA的PCR试剂质控试行参考品的建立

选慢性丙型肝炎病人中HCVRNA含量不等的阳性血清作为阳性标准，采用选自HCV基因5’端非编码区的不同引物来扩增病毒基因，扩增产物与分子量标准进行比较，部分产物用酶切初步分析进行确证。选国家HCV抗体诊断试剂盒临床验证参考品中的阴性样品作为阴性标准，经反复检测显示HCVRNA为阴性。选强阳性血清经5%小牛血清稀释作为灵敏度标准，检测范围为10－5～10－7。应用该参考品对北医肝病研究所的三批HCVRNA诊断试剂盒进行检测，阳性和阴性标准均符合要求，灵敏度为10-5～10-6。

荧光定量PCR技术在检测HCV-RNA中的应用

目的 评价荧光定量ＰＣＲ技术测定ＨＣＶ－ＲＮＡ水平的价值，探讨ＰＢＭＣ中检出ＨＣＶ－ＲＮＡ的意义。方法 采用荧光定量ＫＲ及ＲＴ－ＰＣＲ技术同时检测８７例血液透析患者的血清和淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果血清、淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ的荧光定量ＰＣＲ检出率（４９．４％、６９．０％），分别高于相应标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ阳性率（３３．３％、３５．６％）（Ｐ ＜０．０５）。血清、淋巴细胞中同时检出ＨＣＶ－ＲＮＡ的一致率，荧光定量ＰＣＲ法（３１．０％）显著高于ＲＴ－ＰＣＲ定性法（６．９％）（Ｐ＜０．００１）． 荧光定量ＰＣＲ法，淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ检出率高于血清（Ｐ＜０．０１）。结论 与 ＲＴ－ＰＣＲ相比，荧光定量ＰＣＲ技术检测 ＨＣＶ－ＲＮＡ敏感性较高，对ＰＢＭＣ内ＨＣＶ－ＲＮＡ检测有利于提高ＨＣＶ检测的阳性率。

RT-PCR检测HCV-RNA及基因分型的研究

目的研究HCV基因分型的临床意义。方法应用RT－PCR方法检测HCV－RNA。结果150例献血员中抗-HCV6例阳性占40％，应用RT－PCR方法检测HCV－RNA10例阳性占6．6％，对其进行基因分型，其中HCV－Ⅱ型占89％，HCV-Ⅲ型占11％。结论说明我国人群HCV感染以Ⅱ型为主。12例抗-HCV阳性母亲及新生儿的HCV基因分型同属Ⅱ型，证明HCV母婴垂直传播存在。基因分型诊断为选择药物治疗提供科学依据。

一步短片段RT-PCR方法检测HCV RNA

目的 为了简化传统RT PCR操作步骤。方法 利用TaqDNA聚合酶具有一定的反转录酶活性的特点 ,对HCVRNA短序列进行反转录 ,并对合成的cDNA进行PCR扩增。结果 本法简化了传统RT PCR操作步骤 ,提高了结果的稳定性。结论 本法可用于HCVRNA以及其它RNA的临床诊断。

酶联免疫吸附检测HCV与荧光定量PCR检测HCV RNA对比分析

目的探讨酶联免疫吸附(ELISA)检测抗HCV联合实时荧光定量(RFQ-RT-PCR)法检测血清HCV RNA在丙型肝炎临床诊断中的意义。方法怀疑为丙型肝炎的血清标本以ELISA联合RFQ-RT-PCR法检测。结果在152例标本中,抗-HCV阳性率为77.63%(118/152),73.68%(112/152)的患者HCV RNA含量高于检测下限.两组经χ2检验没有统计学意义(χ2=0.64301,P>0.05)。抗-HCV+HCV RNA(联合)检测HCV阳性率86.84%(132/152)。联合检测阳性率明显高于单独检测组(χ2=4.41363,8.30601。P<0.05)。二者差别有统计学意义(P<0.05)。结论 ELISA联合RFQ-RT-PCR检测HCV是临床诊断丙型肝炎的有力证据,可以大大提高了丙型肝炎病毒的检出率,有利于抗病毒治疗的疗效观察。

化学发光法检测抗-HCV-IgG与荧光定量PCR检测HCV-RNA在丙型肝炎诊断中的临床评价

目的:探讨化学发光法(CLIA)检测抗-HCV-IgG与荧光定量PCR检测HCV-RNA在丙型肝炎(HCV)诊断中的临床价值。方法对106例HCV待查者血清标本,同时采用CLIA法检测抗-HCV-IgG抗体和荧光定量PCR检测HCV-RNA载量。结果106份标本中HCV-RNA阳性率为27.4%(29/106),抗-HCV-IgG阳性率为25.5%(27/106),符合率为82.8%(24/29),经χ2检验,两种方法的阳性率差异无统计学意义(P>0.05),抗-HCV-IgG阳性检出率随着HCV-RNA病毒载量的增高而升高。结论 CLIA法检测抗-HCV-IgG抗体与荧光定量PCR检测HCV-RNA在丙型肝炎诊断中无显著差异,但两者均存在一定的局限性,联合运用能有效降低单独使用的漏检风险,提高检出率,为临床诊断HCV感染提供可靠性依据。

混合血浆荧光定量PCR法筛查献血者HCV RNA的初步研究

目的 研究用荧光定量PCR方法检测混合血浆中的HCV RNA。方法 用12人份混合血浆为基本单元提取HCV RNA,逆转录,四份逆转录产物混合上样于HCV PCR扩增反应体系,用PE5700荧光定量PCR仪检测。HCV RNA质控品检测灵敏度。结果 检测4 128份标本中1例HCV RNA阳性,HCV RNA冻干质控品检测灵敏度为105 IU/ml。结论 48人份混合血浆荧光定量PCR法可用于血液筛查。

荧光定量巢式逆转录PCR(FQ-nRT-PCR)在检测HCV-RNA中的意义

目的:采用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)检测丙型肝炎患者外周血清HCV-RNA,探讨HCV-RNA的临床应用价值。方法:用FQ-nRT-PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测192例HCV感染患者血清,比较HCV-RNA和抗-HCV的临床意义。结果:192例丙型肝炎患者血清标本中,HCV-RNA检出率为75.53%(145/192),抗-HCV检出率为91.66%(176/192)。急性丙型肝炎患者HCV-RNA定量均值达5.21×106拷贝/ml,慢性肝炎次之,肝硬化相对偏低,为5.14×103拷贝/ml。结论:192例丙型肝炎患者抗-HCV检出率高于HCV-RNA检出率,但HCV-RNA对丙型肝炎的早期诊断具有灵敏度高、定量准、假阳性率低等优点,此外在病毒复制水平及抗病毒治疗的疗效评估方面具有重要的临床价值。

荧光定量PCR检测HCVRNA的测量不确定度评定与应用分析

目的:分析研究荧光定量PCR(FQ-PCR)测定HCV RNA的测定不确定度,并进行评定及应用分析。方法:FQ-PCR分析仪选取2个RNA结果呈现阳性的临床样本,分别重复测定10次,对测定HCV RNA测量整个过程分析,确定以及简化测定不确定度的来源,采取不确定度A类评定法和B类评定法,确定合成以及扩展不确定度。结果:其来源包括有批内重复性、湿度时间、方法偏倚、批间重复性以及消毒之前和以后等相关原因。其各个分量当中,由湿度时间造成不确定比例最大,然而批间重复性试验最小。结论:利用FQ-PCR测定HCV RNA测量不确定度的临床研究,对各个实验室检查结果表现趋于一致具有重要意义,能够使来自不同临床实验室的检查结果具有可比性。

实时荧光定量PCR检测特殊人群中HCV-RNA的研究

[目的]探讨HCV在特殊人群中的流行和干扰素治疗效果对HCV-RNA含量的影响。[方法]收集223份抗-HCV阳性血清并跟踪观察和用荧光定量实时荧光定量PCR法检测HCV-RNA的含量。[结果]在141份抗-HCV阳性血清中,58份实时荧光定量PCR阳性,阳性符合率为41.13%,在86份有输血史患者中39份实时荧光定量PCR阳性,阳性率为45.35%,17份有家族遗传史患者中11份实时荧光定量PCR阳性符合率为64.70%。在38例不明原因感染者中有8份实时荧光定量PCR阳性,阳性率为21.05%(2χ=16.21Р=0.000)。58例实时荧光定量PCR阳性的病人经治疗两年后,39份有输血史患者,转阴24例,转阴率61.53%。11份有家族遗传史患者中6例转阴,转阴率54.54%。在8例不明原因感染者中有5例转阴,转阴率62.24%。[结论]不同的传染途径在RNA的含量和治疗的预后有差异。

用PCR分析HCV－RNA NS5部分序列变异

用ＰＣＲ分析ＨＣＶ－ＲＮＡＮＳ５部分序列变异魏来，王宇，陈红松，陶其敏（北京医科大学人民医院肝病研究所，北京１０００４４）对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ｃＤＮＡ的序列分析是验证ＨＣＶ基因分型，确定新的型与亚型的基础￣［１］．经典的序列分析方法需经繁琐的分子...