对比分析PCR结核分枝杆菌DNA检测与常规痰涂片对结核菌检出情况

目的:探讨结核菌检验中PCR结核分枝杆菌DNA检测与常规痰涂片的检出情况。方法:本研究将本院2022年1月—2024年1月收治的肺结核患者60例和非肺结核患者60例作为研究对象,所有研究对象均采用常规痰涂片查找抗酸杆菌、PCR结核分枝杆菌DNA检测。比较两组检测效能(准确度、灵敏度、特异度、阳性特异度、阴性特异度)。结果:PCR结核分枝杆菌DNA检测检出肺结核28例,常规痰涂片找抗酸杆菌检测出肺结核27例,其中PCR结核分枝杆菌DNA检测准确度为95.00%,常规痰涂片准确度为82.50%;PCR结核分枝杆菌DNA检测灵敏度为93.33%,常规痰涂片灵敏度为80.00%;PCR结核分枝杆菌DNA检测特异度为96.67%,常规痰涂片特异度为85.00%;PCR结核分枝杆菌DNA检测阳性预测值为96.55%,常规痰涂片阳性预测值为84.21%;PCR结核分枝杆菌DNA检测阴性预测值为93.55%,常规痰涂片阴性预测值为80.95%,两种检查方式诊断效能比较,PCR结核分枝杆菌DNA检测准确度、灵敏度、特异度、阳性特异度、阴性特异度均比常规痰涂片高,差异显著(P<0.05)。结论:PCR结核分枝杆菌DNA检测方法可以更准确地确定患者是否患有肺结核,这已被证明对肺结核的早期诊断和监测治疗效果非常重要。

荧光定量(PCR)用于乙肝病毒DNA检测的诊断价值

分析荧光定量(PCR)应用于乙肝病毒DNA(HBV-DNA)检测与乙肝病毒标志物(乙肝两对半)化学发光法检测的诊断价值。方法 回顾性分析100例2023年3月至2023年8月我院就诊的乙型肝炎患者HBV-DNA和乙肝两对半结果。乙肝两对半定性检测(血清乙型肝炎病毒标志物)采用磁微粒化学发光法。HBV-DNA则采用荧光定量PCR检测;对两种检测结果进行分析。结果 1(+)、3(+)、5(+)模式(HBsAg、HBeAg、HBcAb同时阳性,即“大三阳”)、1(+)、4(+)、5(+)模式(HBsAg、HBeAb、HBcAb同时阳性,即“小三阳”)分别为30例、39例,占比分别为30.0%、39%。将HBV-DNA表达水平>1*102copies/ml判断为阳性;HBV-DNA定量检测结果显示,全部100例患者中,HBV-DNA检测阳性的患者共有56例,阳性率为56.0%(56/100)。在HBV-DNA阳性率方面,和其他模式相比较,3(+)模式及1(+)、3(+)、5(+)模式均更高(P<0.05),分别为100.0%与96.67%;而在HBV-DNA水平方面,和其他模式相比较,1(+)、3(+)、5(+)模式则更高(P<0.05)。结论 联合HBV-DNA定量检测与乙肝两对半定性检测,能为乙型肝炎的早期诊断及临床用药提供参考。

基于ERIC-PCR技术分析黄连解毒汤对2型糖尿病大鼠肠道菌群结构及DNA同源性的影响

目的:基于ERIC-PCR技术分析黄连解毒汤对2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)大鼠肠道菌群结构及DNA同源性的影响。方法:从36只SD大鼠中随机选取6只作为对照组,其余大鼠给予高脂饲料联合1%链脲佐菌素(30 mg·kg^(-1))建立糖尿病模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、黄连解毒汤高剂量组(6.25 g·kg^(-1))、黄连解毒汤中剂量组(3.13 g·kg^(-1))、黄连解毒汤低剂量组(1.56 g·kg^(-1))及二甲双胍组(100 mg·kg^(-1)),每组各6只。各药物组按照相应剂量灌胃给药,对照组和模型组灌胃等体积生理盐水,连续21 d。第7天、第14天及第21天灌胃后,收集大鼠粪便,提取肠道菌群DNA。利用ERIC-PCR技术和Sanger测序检测大鼠肠道菌群结构与DNA同源性。结果:灌胃第7天,对照组条带较多集中在100~750 bp;与对照组比较,模型组条带在1 000~2 000 bp的亮度增强,在300~750 bp的亮度减弱;与模型组比较,黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组条带在750 bp的亮度增强。灌胃第14天,与模型组比较,黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组条带在1 000 bp以上的亮度减弱。灌胃第21天,与模型组比较,黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组条带在300~750 bp的亮度增强。DNA测序结果显示,灌胃第21天,对照组500 bp条带的优势菌群为拟杆菌属、杜氏邓氏菌和金黄杆菌属;模型组400 bp和1 000 bp条带的优势菌群为梭菌目细菌、普拉梭菌、铜绿假单胞菌和杆菌属。灌胃第7天,黄连解毒汤高剂量组750 bp条带的优势菌群为布劳特菌和拟杆菌属;黄连解毒汤中剂量组200 bp条带的优势菌群为脆弱拟杆菌和拟杆菌属;黄连解毒汤低剂量组1 200 bp条带的优势菌群为双发酵副梭菌;二甲双胍组1 000 bp条带的优势菌群为大肠埃希杆菌。灌胃第14天,黄连解毒汤高剂量组700 bp条带的优势菌群为拟杆菌目细菌和假单胞菌;黄连解毒汤中剂量组550 bp条带的优势菌群为假锁杆菌属和链霉菌属;黄连解毒汤低剂量组350 bp条带的优势菌群为Muribaculum gordoncarteri、肠杆菌、杜氏邓氏菌和杆菌科细菌;二甲双胍组290 bp条带的优势菌群为弗格森埃希菌和大肠埃希杆菌。灌胃第21天,黄连解毒汤高剂量组1 000 bp条带的优势菌群为普雷沃氏菌属;黄连解毒汤中剂量组600 bp条带的优势菌群为Muribaculum gordoncarteri、杜氏邓氏菌和拟杆菌属;二甲双胍组400 bp条带的优势菌属为Muribaculum gordoncarteri、肠杆菌、普雷沃氏菌属、杆菌科细菌和杆菌属。结论:黄连解毒汤对T2DM大鼠的肠道菌群结构具有调节作用,菌群调节效果受药物剂量和治疗时间的影响。

HBsAg ELISA+/HBV DNA NAT-献血者血清学与分子生物学特征分析

目的 了解西安地区无偿献血人群HBsAg ELISA检测结果与HBV DNA检测结果不一致的标本相关血清学标志物的分布情况。方法 收集2022年11月1日—2023年4月30日陕西省血液中心HBsAg ELISA+/HBV DNA NAT-(ELISA+/NAT-)标本共计71份,对其采用电化学发光法检测乙肝血清学标志物,同时复检巢式PCR扩增HBV S区和C区基因片段。结果 双ELISA+/NAT-标本(n=30)巢式PCR检测阳性率远高于单ELISA+/NAT-标本(n=41)(60%vs 24.40%,P<0.05)。前者献血者100%为初次献血者,血清抗-HBc阳性率100%,血清学模式以1、4、5此3项阳性(80%)为主;后者献血者中31.7%为重复献血者,血清抗-HBc阳性率仅为19.51%,血清学模式以单2项阳性(43.90%)和全阴(36.58%)为主。结论 单ELISA+结果存在较多假阳性,导致不必要的血液报废;而NAT-标本可能存在低水平的HBV DNA,产生漏检风险。建议针对单HBsAg ELISA+/NAT-献血者,采用多套系统多种方法追溯检测,提高献血者HBV筛查的准确度,减少不必要的血液浪费。

DNA提取方法对实时荧光定量PCR检测花生过敏原Ara h 2基因的比较研究

食物过敏是一个世界性的公共卫生问题,其中花生过敏最为严重。基于DNA的分子生物学检测方法目前已广泛应用于花生过敏原检测,样品DNA的提取质量会显著影响检测的灵敏度及准确率。本研究比较了5种DNA提取方法,包括十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)法、柱式法及3种基于磁珠纯化技术的DNA快速提取法,对生花生、煮花生、炸花生、烤花生、花生酥和花生酱6种不同加工方式的花生基质样品进行DNA提取,考察了不同方法获得的DNA浓度、纯度指标,并采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)对花生过敏原Ara h 2基因进行了检测分析。结果表明,月桂酰肌氨酸钠(Sodium Lauroyl Sarcosine)磁珠法的适用性广、提取率高,对于6种花生基质提取的DNA均能高效检出花生过敏原Ara h 2基因;对于花生质量分数为0.05%~1.00%的小麦粉二元混合物,SLS磁珠法的DNA提取率总体优于CTAB法,并且能有效提取出与花生共用1条生产线的燕麦片中污染的花生DNA,证实SLS磁珠法提取的实际样品DNA能够满足花生过敏原检测目的。本研究为花生及其制品DNA提取方法提供了参考,特别是磁珠类方法,高效快速,提取质量能够保障后续基于DNA的花生过敏原分子生物学方法检测结果的准确性。

基于DNA条形码和特异性PCR技术鉴别蚂蟥及其常见伪品

目的:建立蚂蟥特异性PCR鉴别方法,能够快速准确地鉴别蚂蟥与其常见伪品。方法:通过分析蚂蟥与其常见伪品的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)序列,寻找蚂蟥SNP变异位点,设计特异性引物;通过对退火温度、循环次数、DNA模板量及Taq酶等关键因素的考察,确立最优反应体系及条件,并将特异性PCR方法应用到水蛭(蚂蟥)粉末中进行药材粉末的基原鉴别,同时为保证试验结果的准确性,将PCR扩增产物进行一代测序。结果:特异性PCR结果表明蚂蟥在400~600 bp有单一明亮条带,常见混伪品则无此条带,试验结果与一代测序结果一致,为蚂蟥。结论:该方法能够将蚂蟥与其常见伪品菲牛蛭、东北小水蛭、黑条、小黑条等区别,且能鉴别水蛭(蚂蟥)粉的基原,为提升中药监管力度,打击中药掺伪行为提供了强有力的技术支持。

TaqMan多重实时定量PCR快速检测3种常见食源性病原菌

建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时定量PCR(qPCR)方法。依据大肠杆菌O157:H7 tir基因、单增李斯特菌mpl基因和蜡样芽孢杆菌entFM基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行灵敏度、特异性和稳定性试验,同步检测人工染菌牛奶样品中的病原菌并与国家标准方法作对比。结果表明,建立的多重qPCR方法灵敏度高,最低检出限为12 CFU/mL;特异性强,只对3种目标菌进行PCR扩增;稳定性好,各重复性试验中Ct值的变异系数<1%;所有受污染样品阳性检出率均为100%,与国家标准方法检测结果一致,且检测周期缩短至6 h。本研究建立的TaqMan多重qPCR方法能同时快速、准确地检测乳品中的大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌,为食品安全提供技术支撑。

荧光定量PCR方法检测头孢类产品中的残留DNA

目的荧光实时定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RTFQ-PCR)检测头孢类产品中残留DNA方法开发、验证及应用。方法采用柱式游离DNA抽提试剂盒(离心柱法)提取供试品中残留DNA;将已知浓度的产黄枝顶孢霉基因组DNA标准溶液系列稀释后,根据DNA标准溶液的循环阈值与浓度之间的线性关系,对5种头孢类产品中的残留DNA进行定量分析;对方法进行专属性、线性和范围、准确度、精密度验证,并使用该方法对5种头孢类产品进行残留DNA检测。结果DNA标准溶液的线性范围为10 fg/μL~1 ng/μL、相关系数R^(2)>0.99、扩增效率为90%~110%、LOD相当于83 pg/g,质控样品回收率为50%~150%,供试品相对标准偏差(RSD)均小于30%,方法学验证的各项参数均符合规定。结论离心柱法结合qPCR探针法能够简便、快速、准确地对5种头孢类抗生素中的残留DNA进行定量测定,方法的专属性、线性、准确度、精密度等各项指标均可达到方法验证的要求,适用于头孢类产品中残留DNA的检测,对其他发酵或半合成抗生素的质量控制具有借鉴意义。

数字PCR检测尿液循环DNA甲基化的方法学性能评价

目的基于尿液中的谷胱甘肽硫转移酶P1(glutathione S-transferase pi-1,GSTP1)基因,对微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测循环DNA甲基化的方法学进行性能评价。方法根据甲基化检测试剂盒相关IVD产品的注册指南,主要从引物探针特异性、灵敏度、批内精密度、批间精密度、准确度5个方面对数字PCR检测尿液循环DNA甲基化进行性能评价。结果GSTP1基因仅在前列腺癌样本中生成明显阳性微滴,在胃癌、肝癌、肾细胞癌、肺癌、膀胱癌、尿道癌、结直肠癌和胰腺癌中不生成阳性微滴,引物探针特异性良好;GSTP1基因的检测限为0.1ng/孔,当DNA输入量大于等于0.1ng/孔时,DNA甲基化情况都可以被检测到,灵敏度较好;批内精密度变异系数均小于6.25%,批间精密度变异系数均小于8.33%,符合CLSI参考文件的标准,表示精密度良好;通过比较数字PCR与荧光定量PCR(Methylight)检测前列腺癌尿液样本GSTP1甲基化情况,相关系数为0.9949,表明两种方法相关性较好,证明数字PCR准确度良好。结论数字PCR检测尿液循环GSTP1基因甲基化的方法在特异性、灵敏度、精密度、准确度均表现良好,符合临床实验室标准,是一种检测尿液循环DNA甲基化的可靠方法。

雅鲁藏布江中游拉萨裸裂尻鱼环境DNA检测及生物量评估

建立快速和准确的环境DNA(eDNA)检测方法,可为鱼类的长期监测提供便利,为鱼类资源保护和管理提供技术支撑。2019年在雅鲁藏布江中游干流及拉鲁湿地和茶巴朗湿地采集了20种鱼和水样,针对拉萨裸裂尻鱼(Schizopygopsis younghusbandi younghusbandi)设计Cytb基因的特异性引物和探针,利用微滴式数字PCR(ddPCR)检测水样中e DNA拷贝数,并分析其与生物量和丰度之间的相关性。结果显示,正反向引物及探针序列与其他19种鱼之间的平均错配碱基数分别为6.8、6.9和3.6,且对其基因组DNA进行ddPCR扩增没有荧光信号。通过对比ddPCR和网捕2种方法,70%样点中检测结果相同,剩余30%样点都是网捕未捕获但ddPCR检出的情况。在拉鲁湿地和雅鲁藏布江干流的样点中,水样eDNA拷贝数与拉萨裸裂尻鱼生物量和丰度之间均具有显著的相关性,拉鲁湿地水样e DNA与二者的相关系数分别为0.987和0.647,雅鲁藏布江水样eDNA与二者的相关系数分别为0.786和0.756,表明eDNA技术是鱼类分布和生物量监测的有效方法。eDNA检测易受到近缘物种和水体理化性质的影响。

单粒蔬菜种子DNA快速提取方法的建立

利用磁珠法对甘蓝、白菜、芥菜、洋葱、黄瓜、番茄、辣椒等7种形状、大小不同的蔬菜单粒种子和幼苗进行DNA提取,采用内参基因Actin进行实时荧光定量PCR评价DNA质量,利用KASP(kompetitive allele specific PCR)标记检验DNA质量是否达到KASP检测要求。结果显示,单粒种子磁珠法提取的各蔬菜DNA平均Ct值均处于19~24范围内。KASP检测进一步证实种子提取DNA的质量达到KASP标记分型的要求。综上所述,本研究建立了一种简单、经济、实用性强的单粒种子DNA提取方法,该方法对不同大小的蔬菜种子具有较好的稳定性,且大幅缩短了获得基因型数据的时间。

数字PCR检测循环肿瘤DNA中HER2基因扩增对胃癌的预后评估

目的探讨基于数字PCR(d PCR)检测循环肿瘤DNA(ctDNA)中人类表皮生长因子受体2(HER2)基因扩增在胃癌进展监测及预后评估的临床应用价值。方法选取2018年11月至2020年12月华中科技大学协和深圳医院收治的60例胃癌患者为病例组,以同期20名健康体检者为对照组。建立dPCR技术方法检测胃癌患者ctDNA中HER2基因扩增及阳性阈值,评价其与免疫组织化学(IHC)联合荧光原位杂交技术(FISH)病理诊断HER2表达结果一致性,分析胃癌患者术前ctDNA中HER2基因扩增与临床病理特征的关系。同时选择24例Ⅲ、Ⅳ期的进展期胃癌患者纳入随访研究,分析术后监测ctDNA中HER2基因扩增与无进展生存时间的关系。结果HER2基因扩增比值的阳性阈值设为1.40,dPCR技术定量检测ctDNA中HER2基因扩增的敏感度、特异性分别达到0.90、0.94;胃癌患者dPCR检测HER2基因扩增、IHC与FISH联合检测HER2表达阳性率分别为20%(12/60)、16.7%(10/60),两种方法检测结果符合率一致性较好(k=0.778,P<0.01)。dPCR检测胃癌患者术前ctDNA的HER2基因扩增阳性患者的肿瘤组织高-中分化、远处转移比例明显高于HER2阴性者,差异有统计学意义(P<0.05)。进展转移组患者ctDNA中HER2基因扩增比值为(1.88±0.76),明显高于无进展转移组的(1.14±0.42),差异有统计学意义(P<0.05)。HER2基因扩增阳性患者的中位无进展生存时间(PFS)为8.5月,明显低于HER2阴性患者的18.9月,风险比率(hazard ratio,HR)为0.321(95%CI:0.12,0.90),差异有统计学意义(P<0.05)。结论利用dPCR技术不仅可以定量检测ctDNA中HER2基因扩增比值水平,还适用于晚期或进展转移胃癌患者术后监测HER2基因扩增变化,对于胃癌进展及预后评估具有一定临床应用意义。

Detection of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using TaqMan-MGB probe technology

AIM: To develop a real-time PCR for detecting hepatitis B virus-(HBV) DNA based on TaqMan technology using a new MGB probe.METHODS: Plasmid containing the sequence of X gene (1414-1744 nt) was constructed as HBV-DNA standard for quantitative analysis. A TaqMan-MGB probe between primers for amplification was designed to detect PCR products. The interested sequence contained in the plasmid and in clinical specimens was quantitatively measured.RESULTS: The detection limit of the assay for HBV DNA was 1 genome equivalent per reaction. A linear standard curve was obtained between 100 and 109 DNA copies/reaction (r＞0.990). None of the negative control samples showed false-positive reactions in duplicate. HBV DNA was detected in 100% (50/50) of HBV patients with HbeAg, and in 72.0% (36/50) with HBsAg, HBeAb and HBcAb. The coefficient of variation for both intra- and inter-experimental variability demonstrated high reproducibility and accuracy.CONCLUSION: Real-time PCR based on TaqMan-MGB probe technology is an excellent method for detection of HBV DNA.

淡水鱼类环境DNA宏条形码引物的筛选及其在千岛湖的应用

基于环境DNA(eDNA)技术的鱼类多样性监测方法因具有灵敏度高、对目标生物无伤害以及成本低等特点,近年来在国内外得到了广泛应用。eDNA方法的有效性往往取决于宏条形码引物的选择,尽管目前已经有一些鱼类环境DNA宏条形码引物,但较少有研究综合评估这些引物的检出效果。本研究评估了来自COI、Cytb、12S rRNA和16S rRNA基因的29对鱼类e DNA宏条形码引物(包括本研究设计的2对和从国内外文献中引用的27对引物),首先基于计算机模拟PCR(in silico PCR)进行了初步分析,随后通过高通量测序对其中效果较好的17对引物开展了更进一步的验证,结果显示:计算机模拟PCR结果良好的引物在进行高通量测序时并非全部表现良好,表明引物的筛选不能仅仅依靠计算机模拟PCR;具有更长扩增片段长度的宏条形码引物并没有获得理想中更好的扩增效果,表现效果好的引物大多是扩增片段长度处于200~300 bp之间的引物;相对于COI和Cytb而言,12S rRNA引物与16S rRNA引物均具有良好的扩增效果,适宜作为鱼类环境DNA宏条形码而用于鱼类多样性研究;同时,鉴于当前的鱼类DNA条形码数据库尚不完备以及不同引物的特性不同,使用多对引物将大大增加物种的检出概率和e DNA研究的可信性。本研究展示了eDNA在评估生物多样性方面的潜力,有助于将来的鱼类eDNA研究,从而为鱼类多样性的保护提供参考。

藜麦FLS基因家族的鉴定、表达及DNA变异分析

【目的】黄酮醇合成酶(FLS)是石竹目植物中多酚类次生代谢的关键酶,为探究FLS基因在藜麦生长发育中的功能,对FLS基因家族进行鉴定和表达分析。【方法】利用生物信息学分析网站,鉴定出CqFLS家族成员,分析其基因结构、蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、启动子顺式元件以及系统进化关系等,并通过基因克隆、构建表达载体的方法分析其蛋白表达情况。【结果】共鉴定出3个CqFLSs基因,不均匀分布在2条染色体上,CqFLSs启动子区域包含水杨酸、脱落酸、茉莉酸甲酯和干旱诱导等元件;CqFLS2.1g发现多处InDel和SNP变异,在ch0128871893、28871125、28872881处编码核苷酸删除,且均注释为上游效应,未检测到移码突变;FLS家族系统进化树分析可知,与其他两个基因相比,CqFLS2.1g与CqFLS1.1g、CqFLS3.10g处于不同分支,表达水平也存在差异,CqFLS2.1g可能发生分化;同时,基因表达分析表明,3个CqFLSs基因在青白1号籽粒中整体表达量高于青黑1号和贡扎4号。对克隆出的CqFLS1.1g用0.3 mmol/L的IPTG诱导,在20℃和37℃的条件下均可成功表达。【结论】CqFLS1.1g在花的形成以及籽粒发育过程中发挥作用,而CqFLS2.1g则主要参与藜麦籽粒的形成,CqFLS的表达具有组织特异性,在藜麦生长发育过程中发挥重要的作用。

实时荧光定量PCR法检测外源性DNA在重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维中的残留

目的对实时荧光定量PCR(qPCR)法检测重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维中的外源性DNA残留量进行探究和分析,确定该方法用于DNA质量控制的可行性。方法采用宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(磁珠法)提取DNA,利用E.coli残留DNA检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行扩增反应,绘制标准曲线,建立重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维中外源性DNA残留量的qPCR检测方法。结果对8批重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维进行测定,外源性DNA残留量在0.03~300 pg/μl内,重复性良好,均远低于每剂10 ng,线性良好(R^(2)>0.99),回收率均在50%~150%之间。结论该方法可用于重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维中外源性DNA残留量的定量测定。

3种褐黄血蜱基因组DNA提取方法的比较

目的在保持褐黄血蜱Haemaphysalis flava寄生蜱虫体形态完整的前提下,综合比较95℃水浴法、改良碱裂解法、离心柱法3种提取方法对蜱组织DNA提取质量的差异,筛选适用于蜱鉴定分型的高效稳定基因组DNA提取方法。方法取蜱标本的一只足作为实验样本,通过95℃水浴法、改良碱裂解法和离心柱法分别提取样品中基因组DNA,检测提取物浓度以及A260/A280和A260/A230比值,并通过PCR技术检测蜱分型相关基因16S rDNA(16S ribosoma DNA,16S核糖DNA)、ITS2(internal transcribed spacer 2,内转录间隔区2)的片段扩增效率,综合分析3种提取方法的优劣。多组之间使用单因素方差分析(ANOVA检验),两组之间比较采用t检验分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果3种提取方法均可获得足量的蜱基因组DNA,改良碱裂解法提取效率显著高于其他2种方法(P<0.05),A260/A280和A260/A230比值结果表明离心柱提取法获得的DNA纯度更高,进一步的PCR实验表明,在模板量一致的情况下,以离心柱法提取的DNA为模板扩增产生的16S rDNA、ITS2片段扩增效率更高,而以95℃水浴法提取的DNA为模板扩增产生的16S rDNA、ITS2片段效率较低。结论离心柱法是提取蜱基因组DNA高效且实用的方法,能够在保持虫体形态完整的情况下满足对寄生蜱进行后续基因分型实验的要求。

探讨实时荧光定量PCR在乙型肝炎病毒DNA定量检测中应用价值

目的:探讨实时荧光定量PCR在乙型肝炎病毒DNA定量检测中应用价值。方法:选择2021年4月至2023年4月我院收治的120例疑似慢性乙型病毒性肝炎患者为研究对象,分别采用实时荧光定量PCR与酶联免疫吸附法(ELISA)对所有患者HBV-DNA含量进行检测。以试纸法检测结果为标准,比较实时荧光定量PCR、ELISA检测结果的一致性;比较实时荧光定量PCR、ELISA对慢性乙型肝炎的诊断效能;比较不同HBV感染状态下HBV-DNA含量的差异。结果:120例疑似慢性乙型肝炎患者经试纸法检查确诊为慢性乙型肝炎107例。Kappa检验分析结果显示,实时荧光定量PCR检查结果与试纸法检查结果具有高度的一致性(Kappa值=0.897,P<0.05)。实时荧光定量PCR对慢性乙型肝炎的诊断灵敏度、特异性与准确率均高于ELISA(P<0.05)。大三阳HBV-DNA含量均高于小三阳与急慢性感染期(P<0.05);小三阳HBV-DNA含量与急慢性感染期比较无明显差异(P>0.05)。结论:实时荧光定量PCR在慢性乙型肝炎诊断中的应用价值较高,不但能完成疾病的准确诊断,还能通过对乙型肝炎病毒DNA定量检测评估患者病情严重程度,为后续治疗方案的制定与改善提供充足数据支持。

实时PCR和cycling probe技术检测母血浆游离胎儿DNA筛选重型β地中海贫血胎儿

目的通过检测孕妇外周血中的游离胎儿DNA来筛选重型β-地中海贫血胎儿。方法选择行产前基因诊断的夫妇6对,孕妇孕周23-26周。血液学检查:胎儿的父亲均为β-地中海贫血17M/N型,孕妇本人为携带除17M/N型之外的另一β-地中海贫血突变类型。针对CD17(A→T)无义突变,设计β-珠蛋白肽链上该等位基因的一对特异性引物和通过cycling probe法分别设计检测正常基因序列和基因突变位点的两条荧光探针,分别用FAM和HEX荧光标记。结合RT-PCR技术检测孕妇外周血中游离胎儿DNA,诊断胎儿是否遗传了其父亲的β地中海贫血17M/N碱基突变位点。同时与脐血血液学检查所诊断的胎儿地贫基因型对照。结果提取的6例孕妇血浆DNA模板中有3例同时显示FAM和HEX荧光信号值阳性结果,即这3例孕妇的胎儿遗传了父亲β-珠蛋白肽链上CD17位点的突变碱基(A→T)。另外3例孕妇血浆DNA模板的FAM信号值阳性,HEX信号值阴性,即所孕胎儿没有遗传父亲的CD17位点的突变碱基。结论利用RT-PCR和cycling probe技术检测孕妇外周血中的游离胎儿DNA可用来筛选患重型地中海贫血的胎儿。

基于DNA条形码、多重PCR、荧光定量PCR对九香虫及其混伪品进行鉴定

目的:基于DNA条形码、多重PCR、荧光定量PCR对市售九香虫、小皱蝽及其掺杂样品进行鉴定。方法:利用通用引物COI进行扩增并测序,构建NJ系统发育树、二级结构并计算种内种间遗传距离;基于COI序列设计九香虫、小皱蝽特异性引物并进行电泳,比较电泳条带;基于COI引物进行SBYR荧光定量PCR,观察单一样品及不同比例混合样品的熔解曲线及其Tm值。结果:利用MEGA 11.0软件分析显示九香虫、小皱蝽分别单独聚为一支,其种间遗传距离均大于0.22,种内遗传距离均小于0.02;两者的二级结构在整体框架具有明显不同。基于特异性引物扩增的九香虫、小皱蝽均出现单一条带,不同比例的混合样品与混合引物进行扩增均出现2条条带。基于COI引物扩增的九香虫、小皱蝽熔解曲线Tm值分别为75℃、89℃,不同比例混合样品的熔解曲线Tm值分别在75.00℃、89.00℃出现两个峰值。结论:DNA条形码能够及二级结构准确鉴定九香虫、小皱蝽;多重PCR及基于SBYR荧光定量PCR不仅能够准确对单一九香虫、小皱蝽进行鉴定,也能够对不同比例的混合样品进行准确鉴定。