PCR/RFLP鉴别禽白血病病毒

用 PCR方法从禽白血病病毒 ( avian leukosis virus,ALV)亚群毒株 RAV-1、RAV-2感染或未感染的SPF鸡胚成纤维细胞 ( CEF)分别扩增出 1 .2 kb基因片段。 RAV-1囊膜基因可被 Bgl 分为 2条相近的 60 0bp片段 ,RAV-2囊膜基因被 Bam H 分为 2条约 60 0 bp片段 ,对照组基因片段 (内源性病毒 )不被 Bgl 和Bam H 切割。结果显示 ,ALV囊膜基因的 PCR/RFLP可用于诊断禽白血病和鉴别不同的 ALV毒株。

应用PCR/RFLP对辽宁、吉林地区恙虫病东方体分离株的基因型分析

目的 鉴定辽宁、吉林地区恙虫病东方体分离株的基因型。方法 采用 PCR/ RFL P技术对辽宁、吉林地区恙虫病东方体分离株的 sta5 6目的基因进行分析研究 ,并与国际参考株进行比较。结果 辽宁、吉林地区 6株分离株的 PCR特异性产物经 Hinf 、Hha 、Rsa 酶切后呈现 2种不同的 RFL P图谱 :HCAa92 0 2株、HCAp92 0 3株及 HCM95 0 1株与 Gilliam参考株具有相似的酶切图谱 ,但缺乏 Hinf 的酶切位点 ;KDCt940 2株、KDCp940 3株及 KDCt940 4株与 Karp参考株具有相同的酶切图谱。结论 KDCt940 2株、KDCp940 3株及 KDCt940 4株属于 Karp型 ;HCAa92 0 2株、HCAp92 0 3株及 HCM95 0 1株属于 Gilliam型 ,但基因序列可能存在遗传差异。

应用PCR/RFLP对山东地区恙虫病东方体的基因型分析

目的 鉴定山东地区恙虫病东方体的基因型。方法 采用聚合酶链反应 /限制性片段长度多态性分析 (PCR/RFLP)技术对恙虫病东方体山东分离株、小盾纤恙螨匀浆及恙虫病病人全血中提取的DNASta5 6基因进行分析研究 ,并与NestedPCR基因分型的结果进行比较。结果 山东地区 35份标本 ( 2 3株恙虫病东方体山东分离株、2份采自黑线姬鼠体外的小盾纤恙螨匀浆及 10份恙虫病人全血 )提取的DNA群引物扩增产物经HinfⅠ、HhaⅠ、SnaBⅠ酶切后呈现 2种不同的RFLP图谱 ,经与已知序列的Ot内切酶图谱相比 :33份Ot内切酶图谱与文献报告的日本地方株—Kawasaki株具有相似的酶切图谱 ,但缺乏HhaⅠ的酶切位点 ;另 2份与Karp参考株具有相同的酶切图谱。该结果与NestedPCR基因分型的结果相一致。结论 山东地区恙虫病东方体流行株主要基因型与日本地方株Kawasaki型类似 ,但与日本地方株存在遗传差异 ;同时还有Karp型Ot存在。采用PCR/RFLP方法可以准确对Ot-Sta5 6基因分型。

恙虫病东方体黑龙江分离株的PCR/RFLP分析

目的 鉴定恙虫病东方体黑龙江分离株的基因型。方法 采用PCR/RFLP技术对恙虫病东方体黑龙江分离株的sta5 6基因及其酶切图谱进行分析研究 ,并与国际参考株进行比较。结果 6株分离株的PCR特异性产物经HinfⅠ、HhaⅠ、RsaⅠ酶切后呈现 3种不同的RFLP图谱 ;MSAa930 1株、MSAa930 3株、MSAa930 4株及MSAp930 5株与Gilliam参考株具有相似的酶切图谱 ,但缺乏HinfⅠ的酶切位点 ,属于Gilliam型 ;MSAa930 6株与Karp参考株具有相同的酶切图谱 ,属于Karp型 ;MSAp930 2株与Kato参考株具有相同的酶切图谱 ,属于Kato型。 结论 黑龙江密山地区恙虫病东方体分离株存在Gilliam、Karp和Kato 3种型别。

用PCR/RFLP方法检测鼠蜱类中斑点热群立克次体的应用研究

目的:探讨PCR/RFLP方法在鼠蜱类中斑点热群立克次体分类学鉴定的意义。方法:利用福建省宁化县林区人群和野鼠中存在斑点热群立克次体(北亚热型、钮扣热型、小蛛型)感染的基础上,通过对蜱类媒介、宿主动物中的肝脏、脾脏等标本及林区人群血清,从中提取斑点热群立克次体DNA,制备PCR模板,用PCR/RFLP方法进行检测。结果:斑点热群立克次体存在着多种种间交叉较为普遍。结论:用PCR/RFLP方法可对鼠蜱类中斑点热群立克次体进行较准确的分离鉴定。

应用PCR/RFLP技术对广西禽白血病病毒的检测与分型研究

对2000～2003年间从广西的南宁、玉林、桂林、钦州、柳州、梧州等地采集的有肿瘤/可疑肿瘤的250份鸡病例进行肿瘤病的检测。结果发现,外源性禽白血病阳性的有32份,阳性率为12.8%。其中,同时为马立克氏病阳性的有30份,两者共感染率高达93.75%(30/32);根据禽白血病病毒囊膜糖蛋白gp85基因的限制性片段长度多态性分析,对其中20份外源性禽白血病病毒进行分型鉴定,结果证实全部属于A亚群。

PCR/RFLP用于恙虫病立克次体基因分析的研究

为查明江苏地区恙虫病立克次体（Ｒｔ）型别及目的基因序列差异性。本室构建Ｒｔ外膜主要蛋白型特异抗原５６ｋＤ的群、型引物进行ＰＣＲ分型。选用ＳｎａＢＩ，ＨｈａＩ和ＢｇｌⅡ限制性核苷酸内切酶切割ＰＣＲ产物（ＰＣＲ／ＲＦＬＰ）方法，对江苏地区的５份Ｒｔ目的基因分析研究与Ｇｉｌｉａｍ，Ｋａｒｐ，Ｋａｔｏ，Ｋａｗａｓａｋｉ和Ｋｕｒｏｋｉ标准参照株Ｒｔ比较，结果证明江苏地区Ｒｔ型别与日本Ｋａｗａｓａｋｉ型相似，但缺乏ＨｈａＩ的酶切位点。

中国禽肾病变IBV分离株S1基因的RT-PCR/RFLP特性

对中国１３个省市分离到的２９个肾病变ＩＢＶ毒株作了Ｓ１基因的ＲＴ－ＰＣＲ／ＲＦＬＰ特性鉴定．用相同的一对引物，８个毒株———广东／０１／８３，河南／０４／９４，河南／０５／９４，内蒙／０１／９３，江苏／０１／９３，河南／０１／９３，天津／０２／９３，内蒙／０２／９３，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增获得了包含有Ｓ１基因ｃＤＮＡ的１７３４ｂｐ的片段；河南／０６／９５的为一１０００ｂｐ左右的片段；其它２０个毒株没有结果．经ＲＦＬＰ分析，广东／０１／８３，河南／０４／９４，河南／０５／９４，内蒙／０１／９３归类于Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｓ血清型，江苏／０１／９３归于Ｇｒａｙ血清型，河南／０１／９３，天津／０２／９３，内蒙／０２／９３是新的变异株．研究结果表明，国内禽肾病变ＩＢ的致病毒株，在不同的地区有其特异的变异株。

鸡传染性支气管炎病毒H株纤突蛋白基因的RT-PCR/RFLP分型

A 1.66 kb expected S1 gene fragment of avian infectious brochitis virus (IBV) H strain was amplified by RT PCR. Its PCR/RFLP pattern was similar to IBV D 41 strain and M 41 strain when digested using BstYI, HaeⅢ and EcoRI respectively. IBV H strain was thought as Massachusetts serotype.

应用PCR/RFLP法检测宫颈癌组织中P^(53)基因杂合性丢失

本文首次在国内建立了PCR/RFLP法检则宫颈癌组织中的P^(53)基因杂合性丢失,以P^(53)基因外显子4中72密码子两侧设计的一对引物进行PCR扩增,产物为162bp。在BSH12361限制性内切酶消化下,8％聚丙烯酰胺凝胶电泳,EB染色,PFLP分析,观察20例宫颈癌组织中有5例为杂合性丢失,1525％(5/20)。该法需微量的标本DNA和快速的特点。PCR/RFLP检则肿瘤组织中的P^(53)基因杂合性丢失方法的建立,将有利于宫颈癌癌变原理研究,并为肿瘤防治新手段的出现,提供新的线索和依据。

南澎列岛恙虫病立克次体分离株的PCR/RFLP分析

目的 利用ＰＣＲ／ＲＦＬＰ方法证实南澎列岛是恙虫病的疫源地并对恙虫病立克次体初步分型。方法 采用套式聚合酶链反应（ＮＰＣＲ）扩增恙虫病立克次体５６ｋＤ蛋白基因片段，阳性标本的扩增产物进行限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分型。结果 南澎列岛的８ 株恙螨／野鼠分离株中７ 株与南澳岛的１ 株扩增出阳性带；ＲＦＬＰ图谱分析表明南澎列岛存在三个型别的立克次体感染，其中一型酶切图谱与Ｋａｒｐ 株相同，一型图谱与Ｋａｔｏ 相同，还有一型既不同于Ｋａｒｐ，也不同于Ｋａｔｏ、Ｇｉｌｌｉａｍ 。并且７株当中有５株为混合感染。南澳岛分离株酶切图谱与Ｋａｒｐ 株相同。结论 本文结果证实了南澎列岛和南澳岛是恙虫病疫源地。南澎列岛上存在三个型别的立克次体。

鸡金银羽位点基因型PCR-RFLP鉴定方法的建立及其应用研究

为了建立一个快速、简便、有效鉴定鸡金银羽位点基因型的方法,试验通过对金银羽等位基因位点核苷酸序列进行分析,设计合成一对引物,应用该对引物对海兰褐、伊莎褐和大午金凤等采用金银羽羽色自别雌雄的蛋鸡配套系商品代公鸡(金银羽等位基因杂合,Ss)和母鸡(金羽等位基因半合子,s-)进行了PCR-RFLP基因型鉴定分析。结果显示,PCR-RFLP方法的鉴定结果与实际基因型一致;采用该方法从960只白羽太行鸡母鸡中鉴定得到3只不携带显性白羽等位基因的银羽母鸡(银羽等位基因半合子,S-);以海兰褐父母代父本公鸡(金羽等位基因纯合,ss)作为父本与用本方法鉴定得到的3只银羽太行鸡母鸡进行杂交,来模拟金银羽自别雌雄的海兰褐蛋鸡商品代鸡的生产,获得的后代雏鸡绒羽颜色表型和性别符合海兰褐商品代鸡金银羽羽色自别雌雄的规律。上述结果表明,建立的PCR-RFLP方法能够快速、简便、有效且低成本地鉴定鸡金银羽位点基因型,为银羽纯合品系的建立提供了一个有效的个体金银羽位点基因型鉴定的方法。

石菖蒲药材及饮片掺混藏菖蒲PCR-RFLP鉴别方法研究

目的通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法建立快速鉴别石菖蒲药材及饮片掺混藏菖蒲的方法。方法对石菖蒲和藏菖蒲的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列酶切位点进行比对分析,选择藏菖蒲的特异性酶切位点AluI,设计PCR-RFLP反应引物,对影响PCR-RFLP反应的退火温度、引物浓度、循环数、酶切时间等条件进行优化,对该方法的准确性进行考察。利用建立的PCR-RFLP鉴别方法对不同产地的石菖蒲、藏菖蒲及掺混样品进行适用性考察。结果建立了石菖蒲药材及饮片掺混藏菖蒲的PCR-RFLP鉴别方法,在退火温度60℃、循环数为30时,藏菖蒲或掺有藏菖蒲的石菖蒲样品经过特异性引物扩增后,能被AluI酶酶切,在100~300 bp检出2条单一DNA条带,石菖蒲样品则无此条带。该方法能对石菖蒲药材及饮片中掺混的藏菖蒲进行准确鉴别,并对石菖蒲中掺入藏菖蒲的检出限为3%。结论建立的PCR-RFLP鉴别方法稳定性好、灵敏度高,可用于石菖蒲与藏菖蒲鉴别及石菖蒲中掺混藏菖蒲的检测,为石菖蒲与藏菖蒲药材的质量控制提供参考。

梅花鹿鞭与马鹿鞭PCR-RFLP鉴别研究

目的建立一种应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)鉴别梅花鹿鞭与马鹿鞭的方法。方法根据梅花鹿与马鹿的细胞色素b基因序列的差异,设计并选取DNA限制性内切酶MseI来区分梅花鹿鞭和马鹿鞭。采用改良SDS法提取样本基因组DNA,经PCR扩增后进行RFLP分析,并优化PCR-RFLP反应体系及反应条件,用优化的PCR-RFLP体系对市售鹿鞭样本进行鉴定。结果经PCR-RFLP分析,MseI可切割梅花鹿与马鹿Cyt b片段,前者被切成2个片段,后者被切成3个片段,从而将两者进行鉴别。结论本实验建立的PCR-RFLP方法可准确鉴别梅花鹿鞭与马鹿鞭。

基于ITS序列PCR-RFLP鉴别大蓟药材及饮片中掺伪飞廉、魁蓟的方法研究

[目的]利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP),建立快速鉴别大蓟混伪品飞廉和魁蓟的方法。[方法]通过比对ITS基因序列,分别筛选飞廉、魁蓟的限制性内切酶位点并设计鉴别引物。考察PCR反应的退火温度、循环数及不同酶的适用性,对酶切反应时间和酶切底物量进行优化。同时对该方法适应性及掺伪比例的专属性、稳定性进行考察。[结果]当退火温度为58~60℃、循环数为30个时,样品均能扩增出一条379 bp的DNA条带。底物为8μL、酶切温度为37℃、酶切反应120 min时,ZraI酶将飞廉切割成120 bp和259 bp两条DNA条带;DNA底物为8μL、酶切温度为37℃、酶切反应60 min时,ApaLI酶将魁蓟切割成126 bp和253 bp两条DNA条带。[结论]试验建立的PCR-RFLP方法能够准确地鉴别大蓟混伪品飞廉、魁蓟,避免此类药材的混用,以保证临床用药安全。

基于ITS序列PCR-RFLP鉴别北柴胡混伪品藏柴胡

目的基于ITS序列用PCR-RFLP方法鉴别北柴胡药材掺伪藏柴胡的方法。方法分析并筛选出藏柴胡特有的限制性内切酶AseⅠ,用Primer Premier 5.0设计特异性引物,对引物PCR扩增条件和酶切试验进行优化,并对该方法的准确性进行了考察。结果PCR扩增的目的片段为331 bp,且建立的PCR反应方法对不同的酶均具有适应性。限制性内切酶AseⅠ将藏柴胡切成79 bp和252 bp两个片段,而北柴胡及其他柴胡均不能被酶切,且掺伪检出限为1%。结论PCR-RFLP方法实现了准确鉴别北柴胡中的混伪品藏柴胡。

套式PCR检测恶性疟原虫Pfcrt基因76号编码多态性及RFLP分析

目的检测恶性疟原虫氯喹抗性转运基因 ( Pfcrt) 76编码多态性及其用该多态性显示恶性疟原虫对氯喹反应性进行评价。方法用套式 PCR/RFLP技术检测现场采集的滤纸血滴上恶性疟原虫 crt基因 76编码的赖氨酸野生型多态性及苏氨酸突变型多态性 ,并对恶性疟原虫的氯喹反应性进行体内法测定。结果 34份滤纸血样中 ,32份的恶性疟原虫 crt基因 76号编码为苏氨酸 (突变型 ) ,突变型比例为 94 .1 2 % ;34份血样中 2 1份做氯喹抗性体内观察 ,该 2 1个病例中 1 4份血样恶性疟原虫 crt基因 76号编码为突变型 ,体内法观察同样显示恶性疟原虫对氯喹有抗性 ,两种方法显示恶性疟原虫对氯喹有抗性的符合率为 66.67%。结论套式 PCR/RFLP检测 Pfcrt基因 76号编码多态性 ,其方法简便、快速 ,但其多态性对氯喹反应性的提示尚需进一步评价。

中外11个猪种H-FABP基因PCR-RFLP的研究

本文利用PCR RFLP技术对五指山猪、沂蒙黑猪、汉江黑猪、莱芜猪、香猪、民猪、成华猪、内江猪、二花脸猪、巴马香猪和大白猪11个猪种共420头猪的心脏脂肪酸结合蛋白基因5′ 端上游区(HinfI RFLP)和第二内含子内(HinfI RFLP、HaeⅢ RFLP)的遗传变异进行了研究。研究表明:(1)在5′ 端上游区的HinfI RFLP位点上,所有的品种都有变异,但沂蒙黑猪和大白猪只有两种基因型(HH、Hh);(2)在第二内含子内的HinfI RFLP位点上,二花脸只有BB基因型,而其它品种都表现出多态性;(3)在第二内含子内的HaeⅢ RFLP位点上,只在五指山猪、香猪和大白猪中发现有多态性存在,等位基因D的频率分别为0 86,0 98和0 68,其余8个猪种均表现为DD型。

小梅山、中梅山及大约克猪的SLA-DQB基因外显子2 PCR-RFLP多态性分析

采用限制性内切核酸酶RsaⅠ对中国地方猪种小梅山、中梅山及国外猪种大约克SLA DQB基因外显子 2的2 73bp扩增产物进行多态性分析。小梅山猪酶切后出现两种基因型 :2 4 6bp 2 7bp(AA)、132bp 84bp 30bp 2 7bp(BB) ;中梅山猪中出现 4种基因型 :2 4 6bp 2 7bp(AA)、132bp 84bp 30bp 2 7bp(BB)、132bp 114bp 2 7bp(CC)、2 4 6bp 132bp 84bp 30bp 2 7bp(AB) ;大约克猪中出现 5种基因型 :2 4 6bp 2 7bp(AA)、132bp 84bp 30bp 2 7bp(BB)、132bp 114bp 2 7bp(CC)、2 4 6bp 132bp 84bp 30bp 2 7bp(AB)、2 73bp 2 4 6bp 2 7bp(AD)。分析发现 ,SLA DQB基因外显子 2的 11、94和 12 4位碱基表现出多态性并在 3个猪种中检测到A、B、C和D 4个等位基因 ;χ2 适合性检验结果表明 ,小梅山、中梅山及大约克SLA DQB基因外显子 2在RsaⅠ酶切位点已经达到了Hardy

IGF2基因PCR-RFLP多态性与脂肪沉积相关性状的关联分析

胰岛素样生长因子 2在胎儿生长发育、肿瘤细胞增殖、肌肉生长等方面具有重要的调控作用 ,是影响猪瘦肉量的主要候选基因。采用PCR RFLP技术 ,分析了IGF2基因第 8内含子部分片段在猪资源家系群体中的NciⅠ酶切片段多态性分布。IGF2基因该片段具有两个NciⅠ酶切位点 (切点位于第 8内含子 ,分别记录为位点A和位点B) ,两位点在资源家系中均具有多态性。IGF2基因B位点酶切未突变个体均比酶切突变的个体背膘薄 18 2 8% (P<0 0 1) ,肥肉率低 2 2 4 3% (P <0 0 1) ,瘦肉率高 8 71% (P <0 0 1) ,位点A具有相同的影响趋势。在该研究群体中 ,IGF2基因发挥作用的方式主要为加性效应 。