PCR-DHPLC技术快速检测食品中英诺克李斯特氏菌

应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,建立食品中英诺克李斯特氏菌的快速检测方法.根据英诺克李斯特氏菌的特有基因设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测,并以41株参考菌株做特异性试验.试验结果表明该方法具有很好的特异性,经PCR-DHPLC可检测食品中英诺克李斯特氏菌.该方法可以快速、准确检测英诺克李斯特氏菌,是食品微生物快速检测的新技术.

小鹅瘟病毒和鹅沙门氏菌PCR-DHPLC检测方法

小鹅瘟和沙门氏菌感染是严重危害养鹅业发展的常见病,为了快速、准确地对小鹅瘟、鹅沙门氏菌感染进行诊断,减少这两种病的危害,本试验将这两种病原体的PCR-DHPLC检测方法结合起来,建立一种可以同时检测小鹅瘟和鹅沙门氏菌的方法,并进行了初步应用。结果表明这种新的PCR-DHPLC方法稳定、敏感、特异性强,适合专业检测使用。

凝结芽孢杆菌PCR-DHPLC检测方法

采用多聚酶链式反应结合变性高效液相色谱技术建立了凝结芽孢杆菌的快速检测方法。以编码凝结芽孢杆菌的特异性基因寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因作为靶基因的设计引物,优化PCR体系,以嗜热脂肪芽孢杆菌等23株试验菌株做特异性检测。同时,将标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测。与传统的检测方法相比,该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测时间短并可节省人力,具有快速方便等优点,检测限可达到100 cfu.mL-1,适用于食物中凝结芽孢杆菌的快速检测。

PCR-DHPLC技术快速检测玉米细菌性枯萎病菌

本研究成功建立了玉米细菌性枯萎病菌的PCR检测方法。该方法根据细菌ITS序列的特异性,设计了对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定性点突变的特异性引物及探针,并对5株玉米细菌性枯萎病菌及18种植物原性细菌的DNA进行了PCR、实时荧光PCR及PCR结合变性高效液相色谱技术(PCR-DH-PLC)检测。结果表明,几种方法特异性强,检测灵敏度均为菌液浓度102cfu/mL,PCR-DHPLC技术具有检测成本较低、高通量、自动化程度高、污染风险小及鉴定结果准确等特点,能够满足快速、准确诊断玉米细菌性枯萎病菌的要求。

食品中A型肉毒梭菌PCR-DHPLC检测方法的建立

目的:建立食品中A型肉毒梭菌的快速检测方法。方法:应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,以A型肉毒梭菌的A型肉毒神经毒素基因作为靶基因设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。以非A型肉毒梭菌,产气荚膜梭菌等23株参考菌株做特异性实验;A型肉毒梭菌DNA稀释成不同梯度,做灵敏度实验。结果:与传统的检测方法相比,该方法具有很好的特异性,方法灵敏度较高,最低检出限可达到为111ng/tube。结论:该方法可以快速、准确检测A型肉毒梭菌,是食品中致病菌快速检测的新技术。

乳粉中普通变形杆菌和奇异变形杆菌复合PCR-DHPLC检测技术的建立

应用复合PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,建立乳粉中普通变形杆菌和奇异变形杆菌的高通量检测方法。根据普通变形杆菌的blaA和blaB基因及奇异变形杆菌的ureR基因序列分别设计特异性引物,复合PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测,并以37株参考菌株做特异性试验。试验结果表明,该方法具有很好的特异性,经复合PCR-DHPLC可同时检测乳粉中普通变形杆菌和奇异变形杆菌。该方法可以快速、准确、高通量检测普通变形杆菌和奇异变形杆菌,是乳粉中致病菌高通量检测的新技术。

鹅细小病毒PCR-DHPLC检测方法的建立

为建立一种敏感、自动化,高通量的检测病料中鹅细小病毒(GPV)的PCR-DHPLC检测方法,本研究首先根据GenBank上GPV标准毒株VP3基因序列设计一对引物,建立检测GPV的PCR方法,然后将PCR检测方法与DHPLC法进行有机结合,建立了GPV PCR-DHPLC检测方法。以GPV、鹅副粘病毒、鸭瘟病毒及正常番鸭胚尿囊液进行特异性试验,结果无交叉反应,表明该检测方法具有较高的特异性。对GPV阳性样品检测结果表明该方法的敏感性较高,是常规PCR电泳法的100倍,且具有较好的重复性。对临床上采集的100份疑似病料,分别应用PCR电泳法和本试验建立的PCR-DHPLC方法进行检测,结果阳性符合率为100%。表明该方法具有特异、敏感、快速、重复性好、可高通量检测等优点,可用于临床样品的大批量检测。

猪细环病毒PCR-DHPLC检测技术的建立及应用

为了应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测猪细环病毒1型和2型,根据猪细环病毒的序列特点设计特异性引物,PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测。选择猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型和猪伪狂犬病毒进行特异性试验,无交叉反应。该检测方法具有较好的特异性和重复性;用质粒标准品进行TTSuV1和TTSuV2的PCR-DHPLC检测,灵敏度可达1.0×101拷贝·μL-1。对80份血清样本分别应用实时荧光PCR法、PCR-凝胶电泳法及本文所建立的PCR-DHPLC法与进行检测,发现TTSuV1有63份PCR-DHPLC阳性,63份实时荧光PCR阳性,54份PCR-凝胶电泳阳性;TTSuV2有69份PCR-DHPLC阳性,69份实时荧光PCR阳性,56份PCR-凝胶电泳阳性。本试验建立的PCR-DHPLC法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于TTSuV感染的分子流行病学调查。

PCR-DHPLC检测方法在病毒性出血性败血病诊断中的应用

运用RT-PCR与变性高效液相色谱技术(DHPLC)相结合,建立了对病毒性出血性败血症病毒(VHSV)快速检测方法,根据对VHSV病毒N基因保守序列的分析,设计一对特异性引物,将RT-PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测。同时运用荧光RT-PCR方法进行平行检测。结果表明,该方法与荧光RT-PCR检测结果相同,其特异性强,灵敏度较高,检测限为3 pg的病毒核酸模板,PCR-DHPLC技术具有高通量、自动化程度高等优势,是一种快速有效的检测方法。

食品中五种致病性弧菌MPCR-DHPLc检测方法的建立

采用试剂盒法提取5种致病性弧菌(霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌)的基因组DNA。分别合成5对特异性引物,对PCR反应体系进行优化后,建立了5种致病性弧菌间的MPCR-DHPLC检测方法。二重PCR-DHPLC检测灵敏度可达到100CFU/ml。建立的MPCR-DHPLC方法在食品中弧菌的检测上具有很好的应用价值。

金黄色葡萄球菌五种肠毒素基因PCR-DHPLC检测方法的建立

本文设计合成了5种肠毒素基因的特异性引物,对PCR的退火温度、DNA模板量进行优化,建立了5种肠毒素基因(SEA、SEB、SEC、SED、SEE)的聚合酶链式反应-变性高效液相色谱(PCR-DHPLC)检测方法,并测定方法的灵敏度和特异性。结果表明建立的PCR-DHPLC检测方法的特异性很好,灵敏度可达到100cfu/m L。PCR-DHPLC方法具有快速、准确、高通量等优点,在进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的检测上有很好的应用价值。

东方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测方法的建立与初步应用

为建立检测东方马脑脊髓炎病毒(EEEV)的方法,本研究利用PCR结合变性高效液相色谱技术(DHPLC),针对EEEV NS1基因,设计特异性引物,通过优化反应条件,对核酸扩增产物采用DHPLC进行检测分析,核酸扩增产物形成DHPLC特征峰图,建立了EEEV的PCR-DHPLC快速检测方法。结果显示该方法与其他6种常见马病病毒均无交叉反应,未检测到其他马病病毒的阳性吸收峰,具有较强的特异性;对梯度稀释的标准阳性模板的检测限可达到10拷贝/μL;利用本研究建立的方法与荧光定量RT-PCR对30份临床样品进行检测,两者符合率达100%。本研究建立的PCR-DHPLC法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可以用于EEE的病原学诊断及流行病学调查。

输血传播病毒PCR-DHPLC检测技术的建立及初步应用

目的应用聚合酶链式反应(PCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测输血传播病毒。方法根据输血传播病毒的核酸序列特点设计特异性引物进行PCR,将扩增产物进行DHPLC检测分析,以验证方法的灵敏度、特异性、重复性,同时进行临床检测的初步应用。结果以乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒进行特异性试验,无交叉反应,具有较好的特异性;重复性良好;灵敏度可达1.0×10~1拷贝/反应。分别应用实时荧光PCR法、普通PCR法及本文所建立的PCR-DHPLC法同时检测32份血清样本,发现有17份样本实时荧光PCR阳性,17份样本PCR-DHPLC阳性,15份普通PCR阳性。结论本文建立的PCR-DHPLC法具有特异、敏感、重复性好等优点,可用于输血传播病毒感染的分子流行病学调查。

多重PCR-DHPLC检测4种主要致腹泻性大肠埃希氏菌方法的建立与应用

肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)和肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)是引起腹泻、危害食品安全和人类健康的4种主要大肠杆菌。本实验基于ETEC LT基因、EPEC bfpA基因、EHEC O抗原基因和EIEC侵袭性质粒基因序列,设计了4对特异性引物,利用聚合酶链反应(PCR)和变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)技术,通过体系优化,建立了致腹泻性大肠杆菌多重PCR-DHPLC检测方法,达到同时检测4种致病菌的目的。该方法灵敏度高,最低检测限为EHEC6×101拷贝/μL、ETEC1.3×102拷贝/μL、EPEC9×101拷贝/μL、EIEC7×101拷贝/μL。特异性试验表明,对22种共41株细菌进行检测,所试6株致腹泻性大肠杆菌均为阳性。实践证明,该方法具有良好的实用性,可用于ETEC、EPEC、EHEC和EIEC的单一或混合感染的检测。

多重PCR结合DHPLC方法检测番茄中转基因成分

应用多重PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,检测转基因番茄华番1号中的转基因成分。对番茄中特异的PG内源基因、华番1号中含有的CAMV35S、NOS和NPTII外源基因进行多重PCR扩增,将扩增产物测序验证。利用DH-PLC分离多重PCR产物,建立了多重PCR-DHPLC技术检测转基因番茄的方法;将样品进行稀释,确定了该方法的检测灵敏度。试验结果表明,所建立的多重PCR-DHPLC方法操作简便,快速准确,能够同时检测转基因番茄4个内、外源基因,检测限达0.5ng/μL,可用于番茄中转基因成分的检测。

应用多重PCR-DHPLC方法快速检测转基因马铃薯及EH92-527-1品系鉴定

以EH92-527-1转基因马铃薯为试材,应用多重PCR技术同时扩增马铃薯的内源基因(UGPase)和外源基因(NOS终止子、NPTII结构基因和EH92-527-1品系特异基因),将扩增产物在DHPLC非变性条件下分离,分析几个基因扩增的结果;将模板进行稀释,确定了方法的检测灵敏度,并与凝胶电泳结果相比较,建立了马铃薯转基因成分筛选检测及品系鉴定的多重PCR-变性高效液相色谱(DHPLC)方法。试验结果表明,该方法能够同时筛选检测转基因马铃薯的四个内、外源基因,且与凝胶成像相比,有更好的检测灵敏度,可达到1 ng/μL。本文首次建立的马铃薯多重PCR-DHPLC检测方法,能够高通量快速准确的检测马铃薯中的转基因成分及对品系进行鉴定。

应用MPCR-DHPLC技术检测转基因大豆及其食品

利用多重PCR结合DHPLC技术,建立了高通量快速筛选检测转基因大豆及其食品的方法,确立了转基因大豆品系鉴定方法。该筛选方法的检测灵敏度为0.078 ng.μL-1,质粒检测灵敏度为1×103拷贝.μL-1。利用该方法对转基因大豆GT-40-3-2、Mon89788、A5704-12和大豆食品曲奇饼干、含大豆的调味粉、干豆腐及非转基因黑大豆进行验证,效果良好。所建立的PCR-DHPLC检测方法能同时快速准确的检测大豆及加工食品中转基因成分。

双重PCR-DHPLC技术快速检测水产品中金黄色葡萄球菌

根据编码金黄色葡萄球菌肠毒素A的sea基因、编码耐热核酸酶的nuc基因为目的基因,设计两对特异性引物,利用聚合酶链式反应结合变性高效液相色谱技术,建立水产品中金黄色葡萄球菌的双重PCR-DHPLC检测方法。以30株参考菌株进行特异性实验,除所试8株金葡菌出现目的片段和阳性吸收峰外,其余菌株均未检测到目的片段与阳性吸收峰,表明该方法具有良好的特异性。灵敏性实验结果表明,检测灵敏度达到菌液浓度50CFU/mL,比普通的凝胶电泳高一个数量级。利用建立的双重PCR-DHPLC检测方法对240份水产品进行检测,共检出22株金黄色葡萄球菌,检出率为9.2%,其中含有肠毒素基因有8株,占总样本的3.3%,与国标法检出阳性率比较无显著差异,证明该方法具有良好的实用性。实验证明,本研究建立的双重PCR-DHPLC方法不仅可以特异、灵敏、简便快速且高通量的实现对水产品中金葡菌的检测,而且也可通过对肠毒素基因的分析,方便地判断出该菌株致病性的强弱。

DHPLC和PCR-SSCP两种方法筛查基因变异的比较

SNP(Single nucleotide polymorphism)被认为是揭示遗传变异最理想的遗传标记,广泛应用于疾病相关的基因筛查、动植物经济性状遗传标记、群体遗传进化等。目前,筛查SNP的方法很多,文章旨在比较DHPLC(Denaturing high performance liquid chromatography)和PCR-SSCP(Polymerase chain reaction-single stranded conformational polymorphism)两种方法在筛查同一基因片段变异的效果,为筛查基因突变的方法提供选择依据。以绵羊孕酮受体基因(PGR)第4外显子为突变筛查对象,以DHPLC和PCR-SSCP两种方法筛查基因变异,以直接测序作为标准,对比分析两种方法在检出率、准确率、经济性和自动化程度等方面的优劣。结果表明:在对391份藏绵羊血液样品的PGR基因进行分析后,SSCP法检出率100%,而DHPLC法检出率仅83.63%;DHPLC法准确率97.25%,高于SSCP法的94.37%;同时操作性和自动化方面DHPLC法要优于SSCP法,但其检测成本比SSCP法高20倍左右;SSCP法应用的广泛性比DHPLC高许多,其中在畜牧和动物医学这两门学科中应用最多,而DHPLC法在人类医学研究中的应用较多。结论:DHPLC法适合运用于基因突变率低和已完全测出基因序列的物种,具有准确率高、操作简单和自动化程度高等优点;SSCP法对基因序列是否已知及突变率高低无要求,具有检出率高、成本低等优点,此法在动物育种领域中应用更为广泛。

PCR结合变性高效液相色谱快速检测水产品中河流弧菌

目的:应用PCR结合变性高效液相色谱技术实现水产品中河流弧菌的快速鉴定。方法:利用河流弧菌的toxR基因序列设计引物,并对该方法进行特异性、精密度和实际应用等方面的考察。结果:用该方法未检测到河流弧菌的近源种及其他细菌的阳性吸收峰,表现出了很好的特异性。结论:用PCR结合变性高效液相色谱检测河流弧菌,不仅特异性好、灵敏度高,且方法简便、快速。