等位基因特异性PCR检测CYP3A5和MDR-1基因多态性方法的建立及临床应用

目的用等位基因特异性PCR(ARMS-PCR)检测细胞色素P450酶CYP3A5(A6986G)和多药耐药基因MDR-1(C3435T)基因多态性,探讨其与肾移植受者他克莫司(Tac)血药浓度和剂量比的相关性。方法根据CYP3A5(A6986G)和MDR-1(C3435T)基因多态性位点分别设计ARMS-PCR引物,分析72例肾移植受者外周血基因组DNA中该2个基因位点的多态性,同时以DNA测序法为金标准进行验证。化学发光微粒子免疫分析法测定肾移植受者血Tac浓度,并比较术后1个月时不同基因型受者之间血Tac浓度、Tac剂量/Tac用量的差异。结果建立的ARMS-PCR法与DNA测序法检测符合率为100%。72例肾移植受者中,CYP3A5*1/*1、*1/*3和*3/*3基因型的发生频率分别为18.1%、31.9%和50.0%,MDR-1 C/C、C/T和T/T基因型的发生频率分别为27.8%、58.3%和13.9%。此外,不同CYP3A5基因型肾移植受者的血Tac浓度(P=0.014)和Tac浓度/Tac用量(P=0.019)均存在明显差异,进一步两两比较发现,CYP3A5*3/*3基因型受者血Tac浓度/Tac用量明显高于*1/*1和*1/*3基因型(P均<0.05)。结论成功建立检测CYP3A5和MDR-1基因多态性的ARMS-PCR法,肾移植受者CYP3A5*3基因多态性与Tac的药代动力学明显相关。

用非同位素PCR－SSCP方法检测p53基因第4外显子多态性

本研究通过对比不同凝胶组成成分及电泳条件，建立了非同位素ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法以检测ｐ５３基因第４外显子第７２密码子的多态性。对３５例正常组织ＤＮＡ的研究结果显示，ｐ５３基因这位点的杂合率和纯合率分别为４８．６％（ＣＣＣ／ＣＧＣ），４５．７％（ＣＧＣ／ＣＧＣ）和５．７％（ＣＣＣ／ＣＣＣ）．本法简单、快速，能有效地检测基因多态性，并可进一步应用于对肿瘤细胞ｐ５３基因杂合性缺失的分析。

新疆三种雅罗鱼属鱼类mtDNA D-loop多态性及起源分化分析

用PCR-RFLP技术,对新疆分布的准噶尔雅罗鱼、贝加尔雅罗鱼和高体雅罗鱼的mtDNA D-loop高变区约827bp进行了扩增,用ScaI、HinfI、AluI、DdeI4种限制性内切核酸酶对56个样本的扩增产物酶切和RFLP分析,共检测到6种单倍型。准噶尔雅罗鱼存在2种单倍型:BDAA和BDBA;贝加尔雅罗鱼存在3种:AAAA、ABAA和ACAA;高体雅罗鱼只有1种。初步认为,准噶尔雅罗鱼、贝加尔雅罗鱼存在较丰富的群体内变异。用6种单倍型及净遗传距离绘制的UPGMA分子系统树,提示准噶尔雅罗鱼有可能是原始种,贝加尔雅罗鱼和高体雅罗鱼是由准噶尔雅罗鱼进化而来。

细胞色素P450酶1A2和2C19基因多态性与难治性抑郁症的关联分析

目的探讨细胞色素P450酶(cytochromeP450enzymes,CYP)1A2、2C19基因多态性与难治性抑郁症的关联。方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增技术及限制性片段长度多态性(RFLP)测定79例难治性抑郁症患者及107名正常对照者CYP1A2C163A、CYP2C19G681A基因多态性。结果两组间基因型及等位基因分布差异无显著性(χ2=3.605,P>0.05;χ2=3.154,P>0.05)。难治性抑郁症患者对照组间基因型及等位基因分布差异无显著性(χ2=0.853,P>0.05;χ2=0.568,P>0.05)。79名患者中46名接受氟西汀合并小剂量利培酮(0.5～2.0mg/d)治疗,将其分为治疗有效组和无效组,两组间CYP1A2C163A(χ2=0.785,P>0.05;χ2=7.142,P>0.05)CYP2C19G681A(χ2=3.008,P>0.05;χ2=2.722,P>0.05)基因型及等位基因分布差异均无显著性。根据CYP2C19G681A基因多态性将患者分为无突变组(G/G型)和突变组(G/A型和A/A型),两组患者CYP1A2C163A基因型及等位基因分布差异无显著性(χ2=0.252,P>0.05;χ2=0.682,P>0.05)。结论CYP1A2C163A和CYP2C19G681A基因多态性与难治性抑郁症无显著关联,不是影响利培酮对氟西汀增效作用的主要因素。

荧光多聚酶链反应测定细胞色素P450 3A5 1*3多态性

目的建立荧光多聚酶链反应测定细胞色素P450 3A51*3的多态性。方法以TaqMan技术为基础,采用等位基因特异性引物,在引物的3′端第二位人为引入一个非配对碱基提高引物的分辨力。对PCR反应的Mg2+和探针浓度进行优化,同时对本方法的灵敏度和精密度进行了研究,应用直接DNA测序法对准确度进行评价。结果优化后的Mg2+和探针浓度分别为3.5mmol/L和0.7μmol/L,批内(n=20)CV为1.41%,批间(n=20)CV为1.72%,在25μl反应体系中,样本DNA浓度5.0×102～5.0×106pg范围内可获满意结果。本法确定的50份标本基因型与直接DNA测序法结果完全一致。结论本法快速、灵敏、可靠,适用于细胞色素P4503A51*3多态性测定。

Pit-1基因在荷斯坦奶牛中的多态性及其与估计育种值的相关性研究

本试验应用PCR-RFLP技术研究了宁波荷斯坦奶牛PIT-1基因的基因和基因型频率;并比较了基因型频率与产奶量估计育种值和乳脂率估计育种值的相关性。结果显示,等位基因A和B的频率分别为28%和72%,基因型AA,AB和BB的频率分别为5.4%,45.9%和48.7%。各基因型间估计育种值均没有表现出显著差异。

CYP2C9基因多态性与华法林应用剂量关系的研究

目的研究细胞色素P450酶2C9(CYP2C9)基因多态性对华法林用药剂量的影响,指导临床用药。方法纳入257例华法林抗凝稳定治疗的患者,以Realtime-PCR法检测CYP2C9*3的基因型,将受试者分为CYP2C9*1/*1、*1/*3、*3/*3共3组,统计分析3组受试者华法林用药剂量,确定患者基因型对华法林剂量的影响。结果在257例受试者中野生型个体(*1/*1)232例,剂量为(4.06±1.72)mg/d;杂合型突变体(*1/*3)20例,剂量为(2.70±1.36)mg/d;纯合突变体(*3/*3)5例,剂量为(0.56±0.25)mg/d。野生型个体服用标准剂量,杂合型突变体用量降低了40%,纯合型突变体用量降低了86%。结论 CYP2C9基因多态性对华法林用量有显著的影响。

分子信标实时PCR检测瘢痕相关p53基因SNP方法的建立

目的建立分子信标实时PCR检测病理性瘢痕相关p53基因第72密码子单核苷酸多态性的新方法。方法采集瘢痕疙瘩患者外周血28例,提取DNA并用分子信标PCR检测p53基因多态性。设计一对p53基因第72密码子单核苷酸多态性荧光分子信标探针,荧光定量PCR检测该位点单核苷酸(SNP),并与反向斑点杂交法,DNA直接测序等方法比较。结果定量荧光PCR荧光分子信标检测的结果与测序结果吻合率达到100%,高于反向斑点杂交法且简便快捷。结论分子信标实时PCR检测技术适合临床p53基因第72密码子单核苷酸多态性快速诊断。

H-FABP基因型对二花脸猪相关性状影响的初步分析

利用21窝不同日龄的二花脸猪共97头,根据日龄分布,分成1组(日龄阶段)—49天,2组—58～60天,3组—61～70天,4组—71～80天,5组—81～90天,6组—228天六个日龄组;采用索氏脂肪抽提法和石蜡组织切片图像分析法对其背最长肌及半腱肌的肌肉组织学特性进行了测定。根据心脏脂肪酸结合蛋白(HeartFatty Acid Binding Protein,H FABP)基因的PCR RFLP多态性,对其与二花脸猪相关性状初生重、20日龄体重、断奶重及肌肉组织学特性的关系进行了分析。所有二花脸猪均表现为AADD型。邓肯氏(Dancans)差异显著性检验结果表明:(1)二花脸猪H FABP基因HH与Hh、hh基因型间20日龄体重差异显著(P<0 05),但对初生重及断奶重无显著影响;三性状值均表现为HH>Hh>hh。(2)在不同的基因型间,没有一个日龄组内的肌肉组织学性状值表现为差异显著,从侯选基因角度分析H FABP基因对肌肉粗脂肪含量的影响,发现趋向于HH>Hh>hh。

门静脉血K-ras和p53基因突变与胃癌肝转移的关系

目的探讨门静脉血K-ras、p53基因突变与胃癌肝转移的关系。方法应用PCR单链构象多态性分析技术,对胃癌患者的门静脉血、外周静脉血分别进行K-ras、p53基因检测,术后随访半年,了解肝转移情况。结果62例胃癌患者外周血和门静脉血中的p53和K-ras基因突变阳性率分别为8.06%、4.83%和38.71%、33.87%;有无肝转移者p53和K-ras基因突变阳性率分别为92.30%、76.92%和24.49%、22.45%;剖腹后探查前或胃癌探查后门静脉血p53和K-ras基因突变阳性率分别为38.71%、33.87%和56.45%、62.90%,上述两组指标之间相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论检测门静脉血K-ras、p53基因突变对预测胃癌肝转移,判断预后有重要意义。

门静脉血K-ras和p53基因突变与胃癌骨转移的关系

目的：探讨门静脉血K-ras、053基因突变与胃癌骨转移的关系。方法：应用PCR-SSCP技术，对胃癌患者的门静脉血、外周静脉血分别进行K-ras、p53基因检测，术后随访1．2—3年，了解骨转移情况。结果：62例胃癌患者外周血和门静脉血中的p53和K-ras突变阳性率分别为8．06％、4．83％和38．71％、33．87％；其中11例发生了骨转移，有无骨转移p53和K-ras突变阳性率分别为81．82％、72．73％和19．92％和13．61％；剖腹后探查前或胃癌探查后门静脉血p53和K-ras突变阳性率分别为38．71％、33，87％和56．45％、62，90％，上述指标两组间比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论：检测门静脉血K-ras、p53基因突变对预测胃癌骨转移，判断预后有重要意义。

Pseudoterranova decipiens复合种的几个姊妹种在线粒体nad4序列的差异

本实验用PCR扩增了来自世界各地的P．decipiens复合种共6个姊妹种的线粒体NADH脱氢酶亚单位Ⅳ基因（nad4），并进行了克隆、测序和序列分析。结果显示，PdOe与Pd为同一种，nad4基因序列种内的变异为0．7％，种间差异为2．4～13．2％。种间差异远大于种内变异，能提供准确的遗传标记。可用于P．decipiens复合种姊妹种的鉴定。这些结果有助于P．decipiens复合种的生活史、传播途径、流行病学、种群遗传学的研究和其所引起的相关疾病的诊断。

建立单管双向荧光PCR方法检测NQO1基因609C／T多态性

目的建立单管双向荧光PCR方法快速测定人NAD（P）H：醌氧化还原酶1[NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQ01]基因609C／T多态性。方法以人NQ01基因中的609C／T位点，设计双向引物，优化反应条件，应用SYBR Green Ⅰ双向荧光PCR扩增191份人基因组DNA标本，并通过对产物进行熔解曲线分析，根据产物Tm值进行等位基因单核苷酸多态性分型。对其中62份标本用经典的PCR-限制性片段长度多态方法进行基因型分型，验证结果准确性。结果62份样本的单管双向荧光PCR方法的基因型结果与PCR-限制性片段长度多态法分型结果符合率100％。191份样本中，纯合野生型（CC）占28％，杂合型（CT）占50％，纯合突变型（TT）占22％。结论单管双向荧光PCR方法检测NQ01基因609C／T多态性，操作简便、反应过程快速，结果直观，敏感性、准确性和稳定性好，适用于临床样本检测及流行病学调查研究。

实时荧光定量PCR检测CYP2C9* 3及VKORC1_C1173T基因多态性方法的建立

建立实时荧光定量PCR法检测人药物代谢基因CYP2C9*3及VKORC1_C1173T多态性,并确定最适反应条件。该方法采用Taq Man-MGB(Minor groove binder,小沟结合物)探针技术,针对每个待检测位点设计特定的引物和探针,并优化引物、探针浓度;建立和优化反应体系,设计合理的PCR Enhancer组分;并对Taq ManMGB探针特异性、敏感性和重复性进行评价,同时对部分实时荧光定量PCR产物样品进行测序验证。结果表明,Taq Man-MGB探针法对2个等位基因检测结果准确,检测方法特异性高;所构建方法线性关系良好(R2≥0.991),扩增效率为95.2%~109.9%,标准曲线斜率为-3^-3.5;检测灵敏度可达10拷贝/反应;随机样品Taq ManMGB探针检测结果与测序结果一致。所建立用于基因多态性检测的Taq Man-MGB探针法具有简便、快速、准确、高效等特点,检测原理可用于各种SNP分型检测,具有广泛的应用前景。

细胞色素P4502D6酶基因多态性与右美沙芬氧化代谢的相关研究

目的 探讨中国人右美沙芬氧化代谢多态性的遗传机理。方法 采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性技术 ,对 119名健康汉族人的肝细胞色素 P45 0 2 D6 (CYP2 D6 )基因型进行分析。结果CYP2 D6 * 10 B的基因频率为 5 8.4% ,其中 13名 (10 .9% )为野生型 (w/ w) ,33名 (2 7.7% )为突变型 (m/ m) ,其余 73名 (6 1.3% )为杂合子 (m/ w)。右美沙芬中速代谢者 (intermediate metabolizer,IM)表型中有约 70 %是由 CYP2 D6 * 10 B m/ m造成的 ,而 1名弱代谢者 (poor metabolizer,PM)亦为 m/ m型。另外 ,10名受试者不存在与白种人 PM相关的 6种缺陷 CYP2 D6等位基因。结论 中国人 CYP2 D6 * 10

P53（rs1042522）基因多态性与子宫内膜异位症易感性的相关研究

目的探讨肿瘤抑制基因P53（tumorsuppressorgene，P53）多态性与子宫内膜异位症（endometriosis，EM）遗传易感性的相关性。方法应用等位基因特异性PCR技术结合DNA测序的方法对460例EM患者、650例无EM妇女（对照组）及113例子宫内膜癌患者的P53基因rs1042522位点（G／C）多态性进行分析。结果各组均存在P53（rs1042522）G／C多态性，且P53（rs1042522）位点等位基因及基因型的分布在EM组与对照组之间差异有统计学意义（P值均小于0．01），其中等位基因C使EM发病风险提高1．179倍，等位基因G使其风险降低0．854倍；GC与GG基因型相比患EM的危险度增高1．548倍（95％CI为1．153～2．081），CC与GG基因型相比患EM的危险度增高1．865倍（95％CI为1．326～2．625）。P53（rs1042522）位点等位基因及基因型的分布在子宫内膜癌组与对照组之间差异有统计学意义（P值均小于0．01），且等位基因C使内膜癌发病风险提高1．278倍，而等位基因G使其风险降低0．772倍；GC与GG基因型相比患内膜癌的危险度增高2．074倍（95％CI为1．197～3．599），CC与GG基因型相比患内膜癌的危险度增高2．864倍（95％CI为1．557~5．263）。P53（rs1042522）位点等位基因及基因型的分布在EM组与子宫内膜癌组之间差异无统计学意义。结论P53基因rs1042522位点（G／C）的单核苷酸多态性与EM遗传易感性存在相关性，且从遗传学角度分析，EM的发病机制可能更类似于肿瘤。

p53基因第72位密码子多态性与剖宫产术后病理性瘢痕的相关性

目的研究p53基因第72位密码子（codon72）多态性与剖宫产术后病理性瘢痕发生的关系。方法对广州医学院第三附属医院产科行剖宫产术的303例女性，于术后3—5d抽取外周静脉血2ml，用荧光分子信标PCR法检测其血液标本的p53基因codon72多态性。分别于术后第3、6、12个月对所有病例进行电话随访，其中有19例随访至18个月，观察其病理性瘢痕发生情况，以及其与p53基因codon72多态性位点基因型的关系。用SPSS13．0软件进行统计学分析。结果303例产妇中发生病理性瘢痕增生30例，273例为正常愈合。2组产妇p53基因codon723种基因型（C／C、C／G和G／G）频率总体上有显著差异；病理性瘢痕增生组产妇C／C基因型频率为46．7％（14／30），高于正常组的17．6％（48／273），差异有统计学意义（P〈0．01）；在病理性瘢痕增生产妇中，C／C基因型频率显著高于C／G型（33．3％，10／30）和G／G型（20．0％，6／30），差异均有统计学意义（P〈0．01）；在病理性瘢痕增生产妇中，c等位基因频率为63．3％，也显著高于G等位基因频率（36．7％，P〈0．01），OR值为2．30。结论p53基因codon72C等位基因与剖宫产术后病理性瘢痕的发生有一定的关联性。

SNaPshot技术检测乙型肝炎病毒基因组P基因区单核苷酸多态性的研究

目的 建立SNaPshot技术对乙型肝炎病毒(HBV)基因组P基因区单核苷酸多态性(SNP)的分析。方法 针对HBVYMDD变异位置的上、下游设计引物,用PCR方法进行DNA扩增,产物直接测序或克隆测序。再针对变异位点74 1A G变异型(YVDD)和74 3G T变异型(YIDD)的紧邻上游设计高度特异的SNaPshot检测引物,用不同荧光标记的ddNTP对PCR产物进行一步延伸,然后置于310型DNA测序仪上观察荧光信号,可直观的检测上述两位点的单核苷酸多态性。结果 在拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者中,经测序证实P基因区不仅存在74 1、74 3位点的变异,还存在5 14C A、5 2 3C A、5 6 2T A、6 6 7C A等位点的变异。对已证实P基因区变异的13例患者血清用SNaPshot技术检测YMDD结果与测序结果完全相同,显示SNaPshot技术高度的特异性。结论 SNaPshot技术检测HBV基因组SNPs具有快速、简便、准确特异的特点,还检测到野生株和变异株的混合存在。

肺癌易感性标记物与肺癌关系的病例对照研究

目的探讨谷胱甘肽转移酶(GST)和细胞色素CYP1A1、CYP2E1多态性与肺癌易感性的关系。方法用病例对照研究方法,收集广东籍新发原发性肺癌病人91例及同期非肺部疾患住院病人91例作对照,采用聚合酶链式反应(PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)技术检测病例和对照的CYP1A1、CYP2E1和GSTM1基因多态性。结果CYP1A1突变型(m2m2)与野生型(mlml)比较,OR值1.51;CYP2E1C1C1型与C1C2型比较,OR值1.80;C2C2型与C1C2型比较,OR值5.48;GSTM1基因缺失型与正常型比较;OR值1.26。两种基因联合分析结果表明:GSTM1基因缺失并携带CYPlAlm2m2与GSTM1基因正常并携带CYP1A1m1m1者比较,OR值2.29,GSTM1基因缺失并携带CYP2E1C1C1型者与GSTM1基因正常并携带CYP2E1C1C2型者比较,OR值2.13,携带CYP1A1m2m2型以及CYP2E1C1C1型者与携带CYP1A1m1m1型和CYPE1c1c2型者比较,OR值3.00。3种基因联合作用分析结果表明:携带CYP1A1m2m2型以及CYP2E1C1C1型并且GSTM1基因缺失者比携带CYP1A1m1m1型和CYP2E1c1c2型且GSTM1基因正常者提高了患肺癌的危险性,OR值3.97。结论CYP1A1、CYP2E1和GSTM1在单因素分析中末显示出与肺癌风险的联系,2个基因和3种基因的联合作用似乎可以提高患肺癌的危险性,但无统计学意义。提示这3种基因均不是肺癌个体易感性的主效基因,可能是次效基因。

细胞因子基因多态性与乙型肝炎病毒宫内感染易感性的研究

目的对前期研究发现宫内乙型肝炎病毒(HBV)感染免疫失败儿童表达异常的细胞因子TNFα、IFNγ、IL4和IL10,研究其相关基因位点单核苷酸多态性与HBV宫内感染易感性的关系。方法在确定时限内选择乙型肝炎疫苗随访门诊中符合纳入标准的高危儿童,系宫内感染HBV经免疫接种失败者为Ⅰ组,免疫接种有效者为Ⅱ组和非携带HBV母亲所生健康儿童作对照。应用实时荧光定量PCR技术检测TNFα基因-238位点、IFNγ基因+874位点、IL4基因-590位点和IL10基因-1082位点的单核苷酸多态性。结果TNFα基因-238位点A等位基因频率Ⅰ组显著高于Ⅱ组(χ2=6.797,P<0.05),并与对照组相比较差异有显著性(χ2=9.513,P<0.05),而Ⅱ组与对照组比较χ2=0.047,P>0.05;IFNγ基因+874位点A基因频率Ⅰ组与Ⅱ组比较χ2=7.238,P<0.05,与对照组比较χ2=5.199,P<0.05,Ⅱ组与对照组比较χ2=0.602,P>0.05;IL4基因-590位点C/T等位基因频率Ⅰ组与Ⅱ组比较χ2=0.632,P>0.05,Ⅰ组与对照组比较χ2=0.584,P>0.05,Ⅱ组与对照组比较χ2=0.004,P>0.05;IL10基因-1082位点G等位基因频率Ⅱ组与Ⅰ组比较χ2=10.359,P<0.001,Ⅱ组与对照组比较χ2=35.418,P<0.001,但是Ⅰ组与对照组比较差异无显著性(χ2=1.759,P>0.05)。