牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法的建立与应用

[目的]建立一种诊断绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR方法,确定肺炎支原体感染的靶器官。[方法]根据GenBank网站上登录的绵羊支原体16S rRNA基因序列,设计并合成2对引物,以肺炎支原体菌株基因组DNA为模板,经过PCR反应条件的优化,通过测序验证扩增产物的正确性,建立了绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR检测方法,进而应用建立的方法完成临床阳性病料肺脏、肺淋巴、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤、小肠和外周血检测以及疑似样本肺脏组织的检测。[结果]建立的巢式PCR方法可扩增出864 bp的特异性目的片段,肺脏和肺淋巴为绵羊肺炎支原体感染的靶器官,临床样本巢式PCR检出率与支原体培养鉴定结果的符合率为100%。[结论]建立的绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法可用于临床样本的实验室诊断。

水禽细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。

马立克病病毒PCR检测方法建立与应用

马立克病(Marek’s disease,MD)是由马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染引起的一种免疫抑制性疾病,引发感染鸡的T淋巴细胞组织增生和传染性肿瘤,是危害养禽业的主要免疫抑制病之一。MDV鸡体内发育成熟后,随着皮屑的脱落而进入外界环境中,通过水平传播感染其他鸡只,造成MD的流行。meq基因和病毒编码的端粒酶RNA与MDV直接致瘤相关,其中meq基因对MDV诱导的T淋巴细胞转化至关重要,故meq基因可导致MDV感染鸡T淋巴细胞瘤的形成。常规PCR方法,具有效率高、特异性强、敏感性高等优点,可用于MD的初步诊断和病毒鉴定。因此,建立一种能快速检测MDV的PCR方法对养禽业的健康发展具有重要意义。

美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。

猪流行性腹泻病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立及初步应用

旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异性引物对和探针;通过对反应体系和反应条件的优化,成功建立了可用于检测PEDV的荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time PCR,FQ-PCR)方法,将自行建立的FQ-PCR方法的引物对/探针用来确定ddPCR方法;对ddPCR方法进行敏感性、特异性、重复性和初步应用试验。结果显示:自行建立的FQ-PCR方法在敏感性、重复性等方面均优于行标FQ-PCR方法;根据自行设计的FQ-PCR方法建立的ddPCR方法最低检测极限为0.15 copies·μL^(-1),敏感性高于行业标准(SN/T 1699—2017)FQ-PCR方法(1.0×10^(1)copies·μL^(-1));模板浓度为1.0×10^(0)~1.0×10^(4)copies·μL^(-1)时,具有良好的线性关系(R 2>0.99);批内、批间变异系数(CV%)为1.52%~7.40%;对猪丁型冠状病毒、猪伪狂犬病毒等11种对照病毒核酸检测结果均为阴性;分别用建立的ddPCR方法、行业标准FQ-PCR方法对150份临床样品进行PEDV核酸检测,ddPCR方法对行业标准FQ-PCR方法检测阳性样品的检测符合率为10^(0)%。本研究成功建立的PEDV ddPCR检测方法可用于临床上PEDV感染的早期检测和定量检测,为PEDV核酸标准物质的研制提供了定量手段。

鸽腺病毒通用型实时荧光PCR检测方法的建立与应用

鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAdV)是影响鸽产业健康发展的重要病原之一。为实现PiAdV的高通量快速检测,根据GeneBank登录的PiAdV-A种和PiAdV-B种病毒pⅧ基因序列的共同保守区域设计特异性检测引物和探针,经反应条件优化,建立了一种PiAdV通用型实时荧光PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示:该方法的最佳探针浓度为0.2μmol/L,与鸽群其他常见病毒无交叉反应,对PiAdV的最低检测限为56.9 copies/μL,比常规PCR敏感性高100倍,组内和组间重复变异系数均小于1.8%。利用该方法和常规PCR方法对20份疑似PiAdV感染样品进行检测,发现PiAdV通用型实时荧光PCR检测方法的病毒阳性检出率高于常规PCR方法。结果表明,本研究建立的PiAdV通用型实时荧光PCR检测方法特异性强、敏感性高、可靠性好,可用于PiAdV感染的临床检测及流行病学调查。

水貂圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10^(6)~1.0×10^(1) copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10^(1) copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10^(-2) pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。

荞麦源性成分实时荧光PCR检测方法的建立

为检测荞麦类食品及原料中的荞麦源性成分,根据荞麦品种DW-1核酸序列信息(KY945277.1)设计了荞麦品种特异性引物;以苦荞和甜荞品种基因组为模板,建立了荞麦源性成分的实时荧光PCR(qPCR)的检测方法,并对购自市场的多个粮食产品进行检测,检测结果与商品标识相符方法特异性强、灵敏度高,为食品中荞麦源性成分的检测提供了新思路。

羊贝氏柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立检测贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)实时荧光定量PCR方法,根据GenBank上收录的C.burnetii RSA439株com1基因序列(CP040059.1)保守区设计特异性引物和探针,并构建重组质粒及优化反应条件,以期建立一种检测贝氏柯克斯体的Taq Man荧光定量PCR方法。结果显示,该方法所建立标准曲线线性关系良好;敏感性试验结果显示,最低检出限为2.45×10^(2) copies/μL,与PCR最低检出限为2.45×10^(4) copies/μL相比较,灵敏度提高了100倍;对羊支原体、羊流产衣原体、羊布鲁氏菌等均无交叉反应,批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于3%,说明特异性、重复性好;利用该方法对收集的126份样品进行检测,结果显示样品阳性率为9.52%,常规PCR检测阳性率为7.14%,符合率为90.47%。该方法可为贝氏柯克斯体临床上快速检测及防控提供技术支持。

鸡金银羽位点基因型PCR-RFLP鉴定方法的建立及其应用研究

为了建立一个快速、简便、有效鉴定鸡金银羽位点基因型的方法,试验通过对金银羽等位基因位点核苷酸序列进行分析,设计合成一对引物,应用该对引物对海兰褐、伊莎褐和大午金凤等采用金银羽羽色自别雌雄的蛋鸡配套系商品代公鸡(金银羽等位基因杂合,Ss)和母鸡(金羽等位基因半合子,s-)进行了PCR-RFLP基因型鉴定分析。结果显示,PCR-RFLP方法的鉴定结果与实际基因型一致;采用该方法从960只白羽太行鸡母鸡中鉴定得到3只不携带显性白羽等位基因的银羽母鸡(银羽等位基因半合子,S-);以海兰褐父母代父本公鸡(金羽等位基因纯合,ss)作为父本与用本方法鉴定得到的3只银羽太行鸡母鸡进行杂交,来模拟金银羽自别雌雄的海兰褐蛋鸡商品代鸡的生产,获得的后代雏鸡绒羽颜色表型和性别符合海兰褐商品代鸡金银羽羽色自别雌雄的规律。上述结果表明,建立的PCR-RFLP方法能够快速、简便、有效且低成本地鉴定鸡金银羽位点基因型,为银羽纯合品系的建立提供了一个有效的个体金银羽位点基因型鉴定的方法。

实时荧光定量PCR检测猴痘病毒的方法研究

目的建立猴痘病毒(mpox virus)的实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测方法。方法以猴痘病毒F3L基因为靶序列,设计特异性引物和探针,建立猴痘病毒RT-PCR检测方法,并对方法的灵敏度、特异性和重复性进行检测;对疑似猴痘阳性的人脓拭子临床样本核酸进行检测,对RT-PCR方法检测临床样本能力进行评价。结果本研究建立的RT-PCR检测方法可实现猴痘病毒的特异性检测,与天花、痘苗、牛痘等其他正痘病毒无交叉反应,检测重复性好,最低检测限为103copies/μL。可以对人皮肤拭子样本中的猴痘病毒进行准确检测。结论本研究建立了猴痘病毒的RT-PCR检测方法,可在临床样本中快速、特异、灵敏的检测猴痘病毒。

基于TashHN基因的牛环形泰勒虫病PCR诊断方法的建立

根据Genbank已发表的环形泰勒虫TashHN基因序列设计合成引物,以此建立基于环形泰勒虫TashHN基因的PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性、稳定性进行验证,并用建立的方法对宁夏固原地区各县共计135份牛血样进行检测。结果表明:建立的基于TashHN的PCR检测方法与中华泰勒虫、东方泰勒虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫均无交叉反应;可检测的最低模板浓度为1.64×10^(2) copies/μL;环形泰勒虫的DNA在-20℃冰箱放置8个月后仍可检测出目的条带;该方法利用已有文献中的PCR方法进行一致性检测,从135份牛血样中检测出5份阳性,说明该方法准确可靠。因此,试验建立的基于环形泰勒虫TashHN基因的PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、稳定性强的特点,适用于临床上环形泰勒虫早期感染检测以及流行病学的调查。

石菖蒲药材及饮片掺混藏菖蒲PCR-RFLP鉴别方法研究

目的通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法建立快速鉴别石菖蒲药材及饮片掺混藏菖蒲的方法。方法对石菖蒲和藏菖蒲的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列酶切位点进行比对分析,选择藏菖蒲的特异性酶切位点AluI,设计PCR-RFLP反应引物,对影响PCR-RFLP反应的退火温度、引物浓度、循环数、酶切时间等条件进行优化,对该方法的准确性进行考察。利用建立的PCR-RFLP鉴别方法对不同产地的石菖蒲、藏菖蒲及掺混样品进行适用性考察。结果建立了石菖蒲药材及饮片掺混藏菖蒲的PCR-RFLP鉴别方法,在退火温度60℃、循环数为30时,藏菖蒲或掺有藏菖蒲的石菖蒲样品经过特异性引物扩增后,能被AluI酶酶切,在100~300 bp检出2条单一DNA条带,石菖蒲样品则无此条带。该方法能对石菖蒲药材及饮片中掺混的藏菖蒲进行准确鉴别,并对石菖蒲中掺入藏菖蒲的检出限为3%。结论建立的PCR-RFLP鉴别方法稳定性好、灵敏度高,可用于石菖蒲与藏菖蒲鉴别及石菖蒲中掺混藏菖蒲的检测,为石菖蒲与藏菖蒲药材的质量控制提供参考。

木糖葡萄球菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

目的本研究拟建立一种灵敏快速的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)方法,用于检测大、小鼠木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus,S.xylosus)。方法本研究选择特异性gehM基因片段作为靶标合成了一套引物,建立了木糖葡萄球菌检测的qPCR方法。对木糖葡萄球菌标准菌株和其他非目标菌进行特异性分析。将木糖葡萄球菌的DNA进行10倍稀释测定其灵敏度。用送检的样本进行了临床应用并测序验证,同时与培养法进行比较。结果仅木糖葡萄球菌出现特异性扩增曲线,而其他非目标菌未出现,表明设计的引物对木糖葡萄球菌具有特异性,灵敏度为100 fg/μL,组内和组间重复性均小于3%。共检测60份临床样品,有5份样品扩增曲线为典型的S曲线,将该qPCR产物克隆测序并进行同源性比对,该序列与木糖葡萄球菌的同源性为99.63%,表明该样本木糖葡萄球菌核酸阳性,所检测样本阳性率为8.3%,而培养法的阳性率为6.7%,qPCR方法阳性检出率比培养法略高。结论建立的木糖葡萄球菌qPCR方法,具有快速、灵敏度高、特异性强和重复性好的优点,可用于实验动物木糖葡萄球菌的检测。

副结核分支杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为加强副结核分支杆菌(MAP)的检测、监测与防控,建立MAP荧光定量PCR(qPCR)检测方法,根据国内MAP流行菌株特异性插入序列IS900设计1对特异性引物和探针,构建重组阳性质粒用作建立qPCR的模板,优化反应体系和条件,验证该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法最低检测限为5拷贝/μL;重复试验中批内和批间变异系数均小于4%;与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛支原体、肺炎克雷伯菌和曼氏杆菌等病原检测无交叉反应,能特异性检出MAP。应用建立的qPCR开展了内蒙古自治区6个市的MAP临床样品检测和流行情况分析,结果显示MAP平均阳性率为0.85%(6/704)。结果表明,成功建立了MAP的实时荧光定量PCR检测方法,可用于临床中MAP的监测和调查,为MAP疾病诊断与监控提供了快捷的方法。

鸡圆环病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速准确检测鸡圆环病毒(CCV),试验根据CCV Rep基因设计特异性引物,以CCV阳性病料提取的DNA为模板进行PCR扩增,构建CCV重组质粒,建立检测CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:试验建立的方法对2.87×10^(8)~2.87×10^(1)copies/μL浓度范围的CCV重组质粒标准品呈现良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9936,灵敏度比常规PCR高100倍;该方法对鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等常见鸡病毒性病原以及多杀性巴氏杆菌、禽致病性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌无特异性扩增,批内和批间变异系数均不超过1%;该方法对60份疑似CCV感染临床样品检测结果显示,CCV阳性检出率(16.67%)高于常规PCR。上述结果表明,研究建立的CCV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,检出限为2.87×10^(1)copies/μL,可以用于CCV的快速定量检测。

乌鳢水泡病毒(SHVV)巢式PCR检测方法的建立与应用

巢式PCR是建立在普通PCR方法基础之上的一种改进型方案,广泛用于病毒基因的检测。但是,目前还没有建立巢式PCR检测乌鳢水泡病毒的报道。本研究通过获取感染乌鳢水泡病毒的杂交鳢组织,获得病毒的相关基因,利用巢式PCR相关技术,通过体系的建立和反应程序的优化,建立一种检测乌鳢水泡病毒的方法,为及时发现并快速诊断乌鳢水泡病毒提供一项重要的技术手段。

致犊牛腹泻大肠杆菌毒力因子多重PCR检测方法的建立

以大肠杆菌4种毒力因子EAST1、FimH、F17、STX1为模板设计特异性引物并优化各项反应条件,建立犊牛腹泻的多重PCR检测方法,利用所建立的多重PCR方法对湖北省某牛场采集的15个样本进行检测。结果表明,在该牛场中携带FimH毒力基因的阳性菌株引起的大肠杆菌广泛存在,携带F17毒力基因的阳性菌株次之,并存在2种毒力基因混合感染的现象。综上所述,该方法的建立为大肠杆菌中常见毒力因子的快速检测及分子流行病学调查提供了新手段。

基于ITS序列PCR-RFLP鉴别大蓟药材及饮片中掺伪飞廉、魁蓟的方法研究

[目的]利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP),建立快速鉴别大蓟混伪品飞廉和魁蓟的方法。[方法]通过比对ITS基因序列,分别筛选飞廉、魁蓟的限制性内切酶位点并设计鉴别引物。考察PCR反应的退火温度、循环数及不同酶的适用性,对酶切反应时间和酶切底物量进行优化。同时对该方法适应性及掺伪比例的专属性、稳定性进行考察。[结果]当退火温度为58~60℃、循环数为30个时,样品均能扩增出一条379 bp的DNA条带。底物为8μL、酶切温度为37℃、酶切反应120 min时,ZraI酶将飞廉切割成120 bp和259 bp两条DNA条带;DNA底物为8μL、酶切温度为37℃、酶切反应60 min时,ApaLI酶将魁蓟切割成126 bp和253 bp两条DNA条带。[结论]试验建立的PCR-RFLP方法能够准确地鉴别大蓟混伪品飞廉、魁蓟,避免此类药材的混用,以保证临床用药安全。