大豆根腐病病原菌PCR-RFLP鉴定体系的建立

利用PCR-RFLP法对大豆根腐病的4种致病菌和3种非致病菌代表菌株进行分子判别研究。结果显示，7个菌株DNA进行PCR扩增得到的rDNA-ITS序列片段长度为600900bp，除立枯丝核菌、瓜果腐霉和毛霉菌代表菌株DNA扩增出的rDNA-ITS片段长度之间没有显著差异外，其他菌株DNA扩增出的rDNA-ITS片段长度差异显著。因此各菌株通过PCR-RFLP法扩增出的rDNA—ITS序列片段之间的大小差异可将侵染大豆的各根腐病致病菌和非致病菌初步区分开。而利用A／uI内切酶对各菌株的PCR产物进行酶切，依据酶切片段之间的大小差异，可进一步将7种菌株区分开，因此利用rDNA-ITS序列分析方法对大豆根腐病这种复合侵染病害的病原菌进行分子判别具有可行性，同时也是建立作物根部复合侵染病害病原种类的分子检测的一种重要方法。

产教研融合助力应用型人才培养——以“基因组DNA的提取与PCR鉴定”项目为例

基因组DNA的提取与PCR鉴定是分子生物学中最基础的技术之一,传统实验教学模式下,学生主体意识缺乏,教学效果不佳。教学团队从教学内容重构、教学方法创新、实验环境创建、教学评价规范化这四个方面对“基因组DNA的提取与PCR鉴定”项目进行重组和创新,以培养学生的创新能力,提高学生学习自主性和分析解决问题的能力。

牛早期胚胎性别鉴定PCR反应体系的优化研究

根据牛SRY基因序列设计合成2对巢式PCR引物作为性别鉴定引物,根据牛酪蛋白基因序列设计了一对引物作为内标引物建立了牛胚胎性别鉴定的PCR反应体系。同时对常规PCR和巢式PCR在牛早期胚胎性别鉴定中的实用性进行比较。15头公牛、13头母牛的DNA样品检测结果表明:使用巢式PCR公牛可以扩增出205bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段,母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段;而使用常规PCR时公牛扩增出255bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段,母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段,其性别鉴定结果和实际完全一致。由于巢式PCR只需10个细胞就可以在紫外透射分析仪下看到扩增结果,而常规PCR则需要20～30个细胞,所以胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。试验采用巢式PCR鉴定了10个奶牛胚胎的性别,同时还对血清是否会对试验结果产生影响进行了研究。

利用mtCOIPCR-RFLP技术鉴定中国境内九个烟粉虱隐种

烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)是一个物种复合体,包括31个以上形态上无法区分的隐种,其中少数隐种是世界性入侵害虫。目前,在中国境内分布有2个入侵隐种和13个土著隐种。快速、高效的鉴别方法对掌握烟粉虱田间发生规律及制定相关防控策略具有重要意义。然而到目前为止,除了mtCOI基因测序比对外,尚未有一种简便的方法可以有效地区分多个烟粉虱隐种。本研究采用mtCOI PCR-RFLP技术,单独或组合使用TaqI,VspI,Van91I,NcoI和FokI这5种限制性内切酶,酶切烟粉虱mtCOI的PCR扩增片段,鉴别分布在中国境内的9个烟粉虱隐种。结果表明,单独使用TaqI酶切,可鉴别出MEAM1和China1两个隐种,使用TaqI+NcoI分步酶切可鉴定出MED和Asia1两个隐种,使用TaqI+Van91I分步酶切可鉴定出Asia II3和Asia II9两个隐种,使用TaqI+VspI+FokI分步酶切可鉴定出Asia II1,Asia II6和Asia II73个隐种。本研究为高效鉴别中国境内的多个烟粉虱隐种提供了方法。

9种检疫性实蝇PCR-RFLP快速鉴定研究

应用PCR RFLP技术 ,对我国口岸截获频率较高的 9种检疫性实蝇开展了快速鉴定方法的研究 ,结果表明 ,设计的 2对引物对 9种供试实蝇线粒体DNA(mtDNA)的PCR扩增片断大小分别约为 350bp和 4 50bp。用限制性内切酶MSE1和DRAI对PCR扩增产物进行酶切 ,得到的酶切位点可将供试的 9种实蝇区分开来。该方法不受供试实蝇地理来源及食物源的影响 ,对各种虫态 (卵、幼虫、蛹 )和不同性别的成虫均适用 ,可用于口岸截获实蝇的快速检疫鉴定。

滩羊生长激素基因PCR-RFLPs反应体系的优化

以宁夏滩羊基因组DNA为模板 ,研究影响滩羊PCR -RFLPs扩增的因素 ,实验结果表明 :特异性引物的浓度、Mg2 + 浓度、模板DNA的完整性 ,浓度、纯度、TaqDNA聚合酶、变性温度、退火温度和循环次数等诸多因素对PCR -RFLPs扩增影响较大。为此我们对PCR -RFLPs的反应体系和反应程序进行了研究和浓度梯度对比试验 ,建立了滩羊GH基因PCR

中国美利奴羊(军垦型)MHC-DRB1基因Nested PCR-RFLP反应体系的优化

本实验针对目前对绵羊MHC-DRB1基因的分析,介绍了利用NestedPCR扩增再进行RFLP反应的方法在中国美利奴(军垦型)上的应用。分析了在NestedPCR-RFLP反应中的一些影响因素,及它的优缺点,建立了绵羊MHC-DRB1基因NestedPCR-RFLP的最佳反应体系。

中国美利奴羊(军垦型)MHC-DRB1基因Nested PCR—RFLP反应体系的优化

试验针对目前对绵羊MHC-DRB1基因的分析,介绍了利用Nested PCR扩增再进行RFLP反应的方法在中国美利奴(军垦型)上的应用。分析了在Nested PCR-RFLP反应中的一些影响因素及它的优缺点,建立了绵羊MHC-DRB1基因Nested PCR-RFLP的最佳反应体系。

半巢式PCR-RFLP法快速鉴定临床标本中的皮肤癣菌

目的探索快速鉴定皮肤癣菌病临床标本中致病菌的分子生物学方法。方法以皮肤癣菌的基因组DNA为模板,采用一对半真菌通用引物(NS5、ITS1、ITS4)行半巢式PCR扩增rDNA上的ITS段,用限制性内切酶BciT130Ⅰ及DdeⅠ酶切目的片段,凝胶电泳。结果7种65株常见皮肤癣菌培养菌株和17例临床标本的半巢式PCR-RFLP图谱特异;且临床标本与相应的培养菌株酶切图谱一致。结论半巢式PCR-RFLP方法适合培养菌株和临床标本病原菌的快速准确鉴定。

PCR/RFLP用于黑龙江立克次体的鉴定

为探讨应用聚合酶链反应/限制性片段长度多态性图谱分析(PCR/RFLP)用于立克次体鉴定的高效性和特异性,将PCR/RFLP用于2株黑龙江立克次体的鉴定,并与以往其它鉴定黑龙江立克次体的分析结果作比较。结果表明,结论一致,均可鉴定出黑龙江立克次体为斑点热群立克次体的一新种。结论:PCR/RFLP以其简便、可信,采用菌体少等优点,适合在实验室进行立克次体研究时广泛应用。

向日葵黑茎病菌分离鉴定及其RFLP分析

【目的】对新疆近期发生的向日葵黑茎病进行病原菌分离鉴定,并对该菌进行RFLP分析。【方法】用常规分离培养法从田间采集的向日葵黑茎病病株获得致病菌,观察该菌的形态学特征;用PCR法对该菌ITS区进行扩增和测序,并与向日葵茎点霉黑茎病菌进行分子比对,明确二者的同源性;选取10种限制性内切酶对该菌的ITS区PCR产物进行RFLP分析。【结果】该菌的形态学特征为茎点霉属真菌,与向日葵茎点霉黑茎病菌的同源性达到99%以上,说明该致病菌为向日葵茎点霉黑茎病菌Phoma helianthi Taberosi。通过RFLP分析确定了该病菌的酶切位点。【结论】该致病菌的形态学和分子生物学鉴定结果表明,向日葵黑茎病由向日葵茎点霉黑茎病菌引起。

应用PCR-RFLP技术鉴别松材线虫与拟松材线虫

应用PCR-RFLP技术分析松材线虫与拟松材线虫之间的差异。实验扩增出松材线虫rDNA-ITS区片段长度约为890 bp,拟松材线虫rDNA-ITS区片段长度约为930 bp。用5种限制性内切酶对两种线虫的ITS区扩增产物进行酶切,结果表明:(1)DraI酶切松材线虫群体均产生两个长度约510 bp和380 bp的片段,而拟松材线虫均不能被DraI酶切;(2)所有的松材线虫群体与拟松材线虫群体的ITS区扩增产物均不能被ApaI酶切;(3)用MspI酶切松材线虫群体,除GZ02不能够被酶切外,其余样本能够产生两条长度分别为530 bp和360 bp的谱带。拟松材线虫群体,都能产生3条一致的亮带,长度分别为340 bp2、90 bp、180 bp;(4)所有松材线虫样本均不能被SalI酶切,而拟松材线虫群体均能够被酶切为两个720 bp和220 bp的片段;(5)XhoI酶切松材线虫ITS区为两条大小分别为520 bp和370 bp的谱带。而拟松材线虫产生两条大小分别为530 bp和400 bp的谱带。因此,内切酶DraI、SalI可以用于检测松材线虫与拟松材线虫。MspI、ApaI、XhoI不宜用于鉴别松材线虫与拟松材线虫。

PCR-SSCP法快速检测鉴定临床病原菌的探讨

目的 :探讨利用 PCR- SSCP快速检测和鉴别临床病原菌的方法。方法 :采用细菌保守的 1 6 s r RNA基因为模板 ,以 PCR-SSCP方法检测病原菌 ,并以普通 PCR法和 PCR- RFL P法作比较。结果 :普通 PCR法很难从电泳图谱中鉴别细菌 ;PCR-RFCP法电泳图谱虽呈多态性 ,但仍有部分细菌图谱相同和相似 ,不易区分 ;经 PCR- SSCP电泳出来的细菌图谱差异明显 ,可以互相区分。结论 :PCR- SSCP技术能快速简便地检测。

应用rrf(5s)-(23s)间隔区扩增子的RFLP对伯氏疏螺旋体的基因鉴定

作者对吉林省9个地区,分离的12株伯氏疏螺旋体菌株,利用rrf(5s) -rrl(23s)间隔区扩增(RFLP)进行基因分型。同时应用特异性单抗对菌株进行菌株鉴定。结果表明: 12株菌株PCR检测都为B. garinii基因型,菌株鉴定同国内分离株M7相同。(B. garinii基因型常从脑脊液分离出来,损伤神经系统,引起皮肤游走性红斑。该基因型菌株是北方疫苗研制的最佳选择。)该结果为吉林省莱姆病的发病机理、临床症状、诊断治疗、免疫诊断及疫苗制备提供了极有价值的技术性参考依据。

用PCR/RFLP方法检测鼠蜱类中斑点热群立克次体的应用研究

目的:探讨PCR/RFLP方法在鼠蜱类中斑点热群立克次体分类学鉴定的意义。方法:利用福建省宁化县林区人群和野鼠中存在斑点热群立克次体(北亚热型、钮扣热型、小蛛型)感染的基础上,通过对蜱类媒介、宿主动物中的肝脏、脾脏等标本及林区人群血清,从中提取斑点热群立克次体DNA,制备PCR模板,用PCR/RFLP方法进行检测。结果:斑点热群立克次体存在着多种种间交叉较为普遍。结论:用PCR/RFLP方法可对鼠蜱类中斑点热群立克次体进行较准确的分离鉴定。

许氏平鲉微卫星多重PCR体系构建及亲本对子代贡献率

为了探究许氏平鲉(Sebastes schlegelii)交配模式和父本对子代的贡献率,利用本课题组开发的13对许氏平鲉高多态性微卫星标记,基于扩增片段大小、退火温度、引物浓度等条件进行优化组合,成功构建了3个三重和2个两重PCR反应体系。同时设计10雌与10雄许氏平鮋亲鱼自由交尾实验,有4尾雌鱼顺利产仔,运用CERVUS 3.0软件对4个母本、4个家系(每个家系取94个个体)及10个候选父本进行亲权鉴定。结果表明:在双亲基因型已知的情况下,当利用5组多重PCR反应体系鉴定4个家系时,累积排除率均达到0.999 999以上,亲子鉴定准确率均达到100%,可有效鉴定许氏平鲉4个家系的亲权关系;能鉴定到父本数为3~6个,4个家系中父本数依次为6、5、4和3个,雄性亲鱼Ma2和Ma7参与到4个母本交配受精中,Ma3、Ma4、Ma5和Ma10则参与到2个母本交配受精,因此,说明"一雌多雄"和"一雄多雌"的交配模式均存在。在所有子代中,父本对子代的贡献差异很大,贡献率最高的为Ma7、Ma2和Ma6,其总和达到67.82%。其中Ma1和Ma9未发现子代,说明未参与交配或交配受精不成功,其贡献率为0。本研究可为许氏平鲉人工繁育和良种选育提供科学理论依据。

中国大陆绒螯蟹线粒体16S rDNA序列变异与分子鉴定标记

选取了中国大陆东部6个水系合计110个绒螯蟹个体,通过DNA序列测定和PCR/RFLP分析,对线粒体16S rDNA部分片段的序列变异进行研究.结果表明,在401 bp的16S rDNA片段中,合浦绒螯蟹(Eriocheir japonica hepuensis)与中华绒螯蟹(E.j.sinensis)之间存在3～4个固定的碱基替代;合浦绒螯蟹的闽江、九龙江和南流江种群之间未发现碱基变异,表现为1种单元型(C型);中华绒螯蟹长江和辽河的种群中,有1个固定的碱基替代,表现为A,B两种单元型.单元型之间的碱基变异反映了绒螯蟹地理种群之间的遗传歧异.经DraⅠ酶切形成的16S rDNA酶切片段差异,为2个亚种的鉴定提供了一种准确、简捷的DNA分子标记.对长江水系部分水域绒螯蟹的分子鉴定提示,长江下游至长江口以中华绒螯蟹的2个单元型为主,但已混有合浦绒螯蟹的单元型.在江苏、安徽渔场中的饲养种群分别属于单元型A型和B型.16S rDNA的PCR/RFLP差异可作为正确鉴定中华绒螯蟹和合浦绒螯蟹的分子鉴定标记;16S rDNA片段中1个固定位点的碱基替代可作为区分中华绒螯蟹两种单元型的分子鉴定标记.

微生物非培养鉴定技术在临床标本检查中的应用研究

感染性疾病的病原学诊断仍以微生物的分离培养作为"金标准",但能培养成功的仅为少数。绕过分离培养环节,以微生物rRNA/rDNA基因作为种属鉴别序列,设计通用引物(universal primer,up),用PCR扩增标本中微生物的16S rRNA或16S～23S rRNA序列,通过毛细管电泳(CE)进行单链构象多态性(SSCP)和限制性片段长度多态性(RFLP)分析,筛选基因的点突变以达到快速鉴定微生物(到属和种)。用PCR-CE-SSCP和PCR-CE-RFLP分析系统检测了呼吸道、消化道、女性生殖道标本中感染的病原菌;用PCR-CE-SSCP系统检测了男性泌尿道溶脲脲原体两个生物群。建立PCR-CE-RFLP分析系统,用非培养法鉴定技术检测脓汁、肠道和泌尿生殖道标本,检测并鉴定了临床标本中的多种病原菌;对人体肠道菌群进行定性和定量分析,用该法可协助腹泻的病原学诊断;检测生殖道常见的致病菌;用PCR-CE-SSCP系统建立了检测溶脲脲原体两个生物群的方法。微生物的非培养鉴定技术比传统方法缩短20h,为临床感染症的诊断提供快速、准确的依据。结果可见,利用16S～23S rRNA间区基因PCR-CE-RFLP和PCR-CE-SSCP系统可以达到对临床常见病原菌的快速种属鉴定,比传统的细菌培养法具有快速、准确、灵敏的优点,可用于临床感染症的病原学诊断。微生物的非培养鉴定技术将替代培养法而成为病原学诊断新的金标准。

几种鉴定小麦背景中1BL/1RS易位染色体的分子标记方法比较研究

对 5种鉴定小麦背景中 1BL/ 1RS易位染色体的生化和分子标记方法 ,包括酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (A PAGE)、荧光原位杂交 (FISH)、RFLP、RAPD和特异性PCR标记 ,进行比较研究。结果表明 ,RAPD标记难以鉴定1BL/ 1RS易位染色体 ,其余均能对 1BL/ 1RS易位染色体进行有效鉴定。FISH和RFLP方法比较费时费力且花费昂贵 ,而特异性PCR标记又在一定程度上受模板DNA浓度的影响。据此认为 ,APAGE方法是一种简单、快速、经济有效的方法 。