多重PCR—SSP技术应用于HPA-1-17bw基因分型研究和广西壮族人群HPA多态性的分布

目的建立应用于HPA-1—17bw基因分型的多重聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）技术，对广西壮族人群HPA名态性分布进行调查。方法设计多种HPA序列特异性引物的组合，在1个PCR反应体系中用时扩增多个HPA基因，根据扩增片断的有无和大小，指定相应的HPA基因型，并以17例国际合作研究项目提供的HPA对比DNA配组标本，以及100例已知HPA型的血小板供者的DNA标本作验证。使用验证后的技术对2659例无血缘关系的广西牡成人群展开HPA-1—17bw的基因分型和抗原多态性研究。结果建立了由16种PCR引物混合物，其中有6种多重PCR多重PER引物混合液组成的PCR—SSP反应体系，可用于HPA-1～17bw等位基因的检测。以HPA参比DNA配组标本，以及已知HPA型的供者的DNA标本的检测作验证，HPA分型结果完全一致；在2659名广西壮族人群中各HPA等位基因频率分布为：HPA—1α和-16为0．9915和0．0085，HPA．2a和．26为0．9569和0．0431，HPA-3α和-3b为0．5122和0．4878，HPA-5α和-56为0．9850和0．0150。HPA．6a和-66为0．9851和0．0149，HPA-15α和-15b为0．5256和0．4744；HPA-4、HPA-7-14bw、HPA-16—17bw只有a／a的纯合子；HPA-2—3、HPA，6船以及HPA．15均存在a／a和b／b纯合子基因型个体。结论多重PCR-SSP技术应用于HPA基因分型减少了PCR扩增反应数量，节省了人力、物力，HPA分型系统性强，可用于大量标本的HPA-1—17bw基因分型等研究和筛查工作；应用该方法研究证明广西壮族人群HPA多态性分布具有民族特征，有助于对壮族人群血小板免疫学特点的了解。

HLA—A基因座分步PCR—SSP分型研究

目的使HLA基因分型能应用于法医常见检材的个人识别。方法 建立检测HLA—A基因座的分步PCR—SSP方法。先用一对HLA—A基因座特异的引物作第一次扩增,以所得产物为模板,分别用对HLA—A30、A31、A33特异的3对引物作第二次扩增,二次扩增的产物经电泳判型。结果 1130例血清分型为HLA—A30、A31、A33的血痕,其PCR—SSP分型和血清分型的不符合率为29％;室温保存2年的精斑、唾液斑,保存18年的血痕第一次扩增均获得满意的结果。结论法医亲子鉴定和个人识别宜用基因分型替代血清分型。HLA—A基因座分步PCR—SSP基因分型适用于法医检材。

利用PCR—SSP技术检测TAP2等位基因多态性

目的探讨利用聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）技术检测TAP2等位基因多态性的方法及其可行性。方法用盐析法抽提随机健康人群DNA样本，以PCR—SSP技术为基础，根据TAP2＊0101，TAP2＊0102，TAP2＊0103，TAP2＊0201四种等位基因型的全序列特点，选取TAP2mRNA1308C—T，1693A—G，1951C—T等位基因上三个突变住点，使用primer5．0软件设计引物，通过PCR—SSP电泳获得等位基因不同的结果。结果根据PCR-SSP电泳结果获得的不同等位基因的格局图，清晰地得出每个个体的纯合子、杂合子情况，将TAP2所有类型完全分析清楚。结论该方法可确实有效地分型TPA2等位基因，成本低，操作方便，适合大规模批量地进行人群调查。此技术可用于人类群体遗传学调查，为研究TAP2基因多态性与疾病的关联性提供技术平台。

PCR-SSP技术应用于海南汉族HLA-A、B、DRB1基因多态性研究

[目的]研究海南汉族HLA-A、B、DRB1基因多态性,分析该群体HLA等位基因分布特点。[方法]应用顺序引物聚合酶链反应技术对3140名海南汉族健康、无血缘关系的捐献造血干细胞血样者进行HLA-A、B、DRB1基因分型检测,并与其他汉族群体进行比较。[结果]检出A等位基因17个,B等位基因28个,DRB1等位基因13个。其中HLA-A*11(0.3553)、A*02(0.2873)、A*24(0.1946)、A*33(0.1045)、HLA-B*40(0.1896)、B*15(0.1526)、B*13(0.1451)、B*46(0.1285)、B*58(0.1018)、HLA-DRB1*15(0.1649)、DRB1*12(0.1414)、DRB1*04(0.1336)、DRB1*09(0.1287)等位基因具有较高的基因频率。[结论]海南汉族HLA等位基因多态性具有南方汉族人群共同的特征,但可能受北方汉族的影响,具有自身的特点。

人类血小板抗原1～6和Gov系统的PCR-SSP同步基因分型

目的：采用序列特异性引物PCR（PCR—SSP）对人类血小板抗原（HPA）1-6、Gov系统进行同步基因分型，以确定中国大陆汉族人群中的HPA等位基因频率。方法：随机采集100名中国大陆汉族无偿献血者外周血标本，采用酚／氯仿方法提取基因组DNA。设计合成21条序列特异性引物，在相同的PCR循环条件下对HPA-1-6和Gov进行PCR-SSP同步基因分型。结果：100名随机供血者中观察到的基因频率分别是HPA-1a和1b为1．000和0．000，HPA-2a和26为0．995和0．005，HPA-3a和36为0．655和0．345，HPA-4a和46为1．000和0．000，HPA-5a和56为0．990和0．010，HPA-6a和66为0．980和0．020，Gov^a和Gov^b为0．515和0．485。中国人HPA—1．6、Gov的基因频率与亚洲其他人群相一致，HPA-3a／3b和Gov^a／Gov^b基因频率在包括高加索人在内的不同人群中基本相等。结论：中国大陆汉族人群中Gov和HPA-3等位基因分布有其自身特点。

用PCR-SSP方法检测中国恒河猴Mamu-DRB*W101和Mamu-DRB*W201基因

利用序列特异引物聚合酶链反应(polymerase chain reactionsequence-specific primers,PCR-SSP)方法扩增中国恒河猴的主要组织相容性复合体II类基因Mamu-DRB*W101、-DRB*W201,初步了解中国恒河猴中Mamu-DRB*W101、-DRB*W201基因的阳性率。采集中国恒河猴静脉血,用DNA提取试剂盒提取全血DNA,分别用Mamu-DRB*W101、-DRB*W201特异引物PCR扩增Mamu-DRB*W101、-DRB*W201基因的第二外显子区域,并对扩增出的阳性条带进行测序,与已知序列对比验证序列是否正确。共检测了来自136只中国恒河猴的样本,PCR检测出Mamu-DRB*W101阳性个体10只,Mamu-DRB*W201阳性个体也是10只,其阳性个体所占比率均为7.35%。测序结果表明,PCR扩增产物的核苷酸序列与基因库中的序列完全一致。本研究表明中国恒河猴中存在Mamu-DRB*W101、-DRB*W201基因阳性个体,为中国恒河猴在AIDS研究中的应用及进一步分析中国恒河猴MHC II类基因提供了基础。

应用PCR-SSP方法进行人类血小板抗原1～6系统的基因分型

目的研究采用PCR-SSP技术,建立人类血小板抗原1～6系统(HPA-1,2,3,4,5,6)的基因分型方法。方法合成18条序列特异性引物,通过调节引物浓度、Mg2+离子浓度和探索最佳PCR扩增条件,建立HPA-1～6系统同步基因分型技术。对第10届及第11届国际输血协会(ISBT)血小板基因定型协作组送检的考核样本进行盲检来验证。并应用该技术对198名深圳地区健康的血小板志愿捐献者进行基因分型。结果应用本研究的方法,对第10届及第11届ISBT送检的考核样本进行基因分型,结果与ISBT公布的结果完全一致,符合率达100%。对198名随机的血小板志愿捐献者观察到的基因频率分别是:HPA-1a和1b为0.9924和0.0076,HPA-2a和2b为0.9545和0.0455,HPA-3a和3b为0.5556和0.4444,HPA-4a和4b为0.9975和0.0025,HPA-5a和5b为0.9848和0.0152,HPA-6a和6b为0.9798和0.0202。结论本研究建立的HPA基因分型技术具有简便、快速、准确的特点,适合于常规HPA基因分型,具有广泛的应用前景。

HLA-B血清学纯合型标本的PCR-SSP基因分型

目的 探讨血清学和PCR SSP 2种方法在HLA B位点分型的应用价值。方法 对血清学分型HLA B位点纯合型标本 ,用PCR SSP方法进行基因分型。结果 血清学分型为纯合型的 75例标本中 ,PCR SSP方法基因分型有 12例为杂合型。结论HLA B的PCR SSP基因分型结果准确、可靠 ,而血清学分型方法成本低 。

PCR-SSP法与MCLT法检测福建地区强直性脊柱炎疑似患者HLA-B27的比较

目的通过对福建地区877例强直性脊柱炎(AS)疑似患者HLA-B27的检测,比较PCR-SSP法与MCLT法两种检测方法,初步了解本地区AS疑似患者与B27抗原的相关性。方法采用PCR-SSP法、MCLT法检测AS疑似患者HLA-B27表达。结果采用PCR-SSP法检测的379例样本,B27阳性检出率39.84%,采用MCLT法检测的498例样本,B27阳性检出率27.11%;两种方法共同检测样本119例,其中PCR-SSP法检测阳性46例、MCLT法检测阳性39例。877例AS疑似患者B27阳性者男女比例为2.8∶1;其中16～30岁年龄段男性AS疑似患者阳性率最高。结论PCR-SSP法较MCLT法检测HLA-B27准确性高、特异性高、稳定性好,在一定程度上避免了漏检,克服了MCLT法的一些弊端,具有较好的临床适用性。本室检测的877例样本反映出福建地区AS疑似患者HLA-B27阳性男性明显多于女性,且青壮年男性HLA-B27阳性率最高。

PCR-SSP法检测A^(1,2)BO^(1,2)血型基因型

目的 为了建立A1,2 BO1,2 血型系统基因分型的方法 ,以检测人群中A1、A2 、B、O1、O2 基因的频率。方法 采用盐析法进行样品DNA的抽提 ,采用PCR SSP法进行A1,2 BO1,2 血型基因分型。结果 15 8例中A1,2 BO1,2 系统基因频率分别是A1为 18 7% ,A2 为 0 6 % ,B为 17 4% ,O1为 6 2 3% ,O2 为 0 9%。结论 该方法可鉴定出A1,2 BO1,2 血型系统基因 ,中国人群中存在O2 基因。

一种新的HLA─Ⅱ类基因分型方法——PCR／SSP技术的建立

ＰＣＲ／ＳＳＰ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒ，序列特异性引物）是一种新的基因多态性分析技术，可用于ＨＬＡ复合体及其他具有多态性特点的基因分型。我室于１９９３年建立这种方法，并对正常人、重症肌无力患者、全身性红斑狼疮患者、骨髓移植供／受者进行了ＨＬＡ－ＤＲＢ１、－ＤＱＢ１基因型别分析。与其它ＨＬＡ基因分型方法相比，ＰＣＲ／ＳＳＰ具有简便、快速、准确及重复性好等特点。本文介绍ＰＣＲ／ＳＳＰ技术的原理、方法、特点以及常见问题的处理。

PCR-SSP对潜在输血需要住院患者ABO基因分型的检测效果与意义

【目的】调查潜在输血需要住院患者的ABO血型基因,分析ABO表型相同输血中ABO基因型的错配输血几率。【方法】对502例潜在输血需要的住院患者,采用血清学方法和聚合酶链反应-序列特异性扩增技术(PCR-SSP)检测ABO血型的表型及基因型。比较两种方法学对ABO血型表型的一致率;统计各ABO等位基因及各ABO基因型的频率;并分析潜在输血需要的住院患者在接受ABO血型表型相同的输血时,ABO基因错配输血几率。【结果】血清学与PCR-SSP对502例潜在输血需要的住院患者的ABO表型识别的一致率为100%。PCR-SSP技术检测出患者中常见ABO基因5个(O1、O2、A1、B1及A2)以及ABO基因型16个(O1O2、O1O1、B1O1、A1O1、A1O2、B1O2、O2O2、A1B1、A1A1、B1B1、A2O1、A2O2、A2B1和A1A2),而血清学仅能识别ABO表型。潜在输血需要住院的患者在接受ABO血型表型相同的随机输血中,与供者之间ABO基因型的错配率分别为:A型65.98%,B型57.39%,O型56.95%,AB型22.55%。【结论】PCR-SSP能识别ABO基因型,不仅可以作为血清学的有力补充,而且可能揭示输血治疗中不明原因的输血不良反应的临床原因,具有重要临床意义。

用PCR-SSP对HLA-DQB作中分辨法分型

采用PCR-序列特异性引物技术(SSP)对HLA-DQB作中分辨法分型。该方法不仅可行,且操作简便快速,结果准确,适用于临床器官移植配型。

流式细胞术与PCR-SSP法检测HLA-B27的比对及HLA-B27亚型的研究

目的探讨流式细胞术(FCM)与序列特异性引物聚合酶链式反应(PCR-SSP)在人类白细胞表面抗原-B27(HLA-B27)检测中的应用,并观察HLA-B27亚型在本地区的分布情况。方法采用PCR-SSP和FCM检测88例疑似强直性脊柱炎(AS)患者HLA-B27。结果 88例AS疑似患者中FCM法检测HLA-B27结果阳性82例,阴性6例,阳性率为93.2%;PCR-SSP法检测阳性83例、阴性5例、阳性率为94.3%。分型结果 B*2705型41例占49.4%;B*2704型37例占44.5%;B*2702型1例占1.2%;阳性但未分辨型别4例。结论 Kappa一致性系数K=0.905,PCR-SSP法与FCM检测HLA-B27结果具有较高的一致性。本地区易感HLA-B27等位基因亚型主要以HLA-B*2704和HLA-B*2705为主。

多重PCR-SSP方法在RHD基因检测中的应用

目的应用分子生物学诊断方法分析RhD阴性献血者的RHD基因。方法首先采用多重PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)方法扩增377名RhD阴性无偿献血者的RHD基因特异性内含子4和外显子7,对扩增结果为阴性的标本则继续采用PCR-SSP检测RHD基因启动子和外显子10。结果 337名RhD阴性无偿献血者中,24.92%(84/337)为RHD基因内含子4和外显子7阳性,余253例内含子4和外显子7阴性标本中的8.69%(22/253)为启动子和外显子10阳性;本组RhD阴性无偿献血者的RHD基因阳性率为31.45%(106/337)。结论多重PCR-SSP方法检测RHD基因简单易行,可用于对血清学RhD阴性者的RHD基因确认。

PCR-SSP法检测胎儿、新生儿ABO血型

目的 研究用PCR SSP法鉴定胎儿、新生儿血型及基因型。方法 用PCR SSP法检测 5 6例 16周以上孕妇的胎儿、新生儿脐血红细胞基因型 ;用常规法检测双亲及胎儿、新生儿血红细胞ABO血型。结果 用PCR SSP法检测出全部 5 6例脐血ABO血型及基因型 ;PCR SSP法检测出的子代血型与由父母血型按孟德尔遗传规律推测的子代血型符合率达 10 0 % ;用常规法检测脐血ABO血型 ,检出率为 87.5 %。结论 PCR SSP法检测子代ABO血型方法可靠 。

PCR-SSP基因分型技术检出HLA-B新等位基因B＊5516一例

目的 识别确认中国人群的HLA新等位基因。方法 使用PCR SSP以及以测序为基础的分型技术 ,分析HLA新等位基因和B 5 5 0 2基因顺序的差异及血清学方法分析特异性。结果 在四川成都骨髓供者中检测出一例新的HLA B等位基因。该基因和B 5 5 0 2基因顺序的差异 ,只是在外显子 2区域中 97C >A一个碱基取代 ,导致相应的密码子 33由酪氨酸变为组氨酸。血清学分析表明B 5 5 16与B2 2特异性相关。并由此建立起PCR SSP方法鉴定B 5 5 16基因。结论 四川成都骨髓库中检出的HLA B等位基因是HLA新等位基因 ,2 0 0 3年 8月已被世界卫生组织 (WHO)命名为HLA B 5 5 16。在大约 14 0 0例随机骨髓供者中 ,未发现其他带有B 5 5 16基因的个体。

人类血小板抗原HPA-15系统PCR-SSP基因分型技术的建立

本研究目的是采用PCR-SSP技术建立人类血小板抗原HPA-15系统的基因分型方法,并应用于血小板供者库的HPA基因定型。采用第11届国际输血协会(ISBT)血小板血清学与基因分型协作组推荐的序列特异性引物,调节引物浓度、Mg2+离子浓度和探索最佳PCR扩增条件,建立HPA-15系统基因分型技术。该分型技术的准确性和可靠性,采用第11届ISBT血小板协作组提供的质控样本进行验证,同时采用本研究合成的引物及商品化试剂盒,对50名随机的汉族血小板捐献者进行HPA-15系统基因分型,作为平行对照。应用本研究的方法,对第11届ISBT送检的10份考核样本进行基因分型。结果表明:基因分型结果与ISBT公布的结果完全一致。50名随机的血小板志愿捐献者,经本研究的方法及美国G&T公司的试剂检测,基因分型的结果相符合;观察到的基因频率:HPA-15a和-15b分别为0.5100和0.4900。结论:本研究建立的HPA基因分型技术具有简便、快速、准确的特点,适合于常规HPA基因分型,具有广泛的应用前景。

PCR－SSP快速检测胰腺癌石蜡切片中K－ras基因点突变

胰腺癌第１２位点Ｋ－ｒａｓ基因点突变检出率达７２％～１００％，检测其点突变方法有数种。我们采用针对Ｋ－ｒａｓ基因点突变方式设计的引物，对胰腺癌石蜡包埋组织进行多聚酶链反应（ＰＣＲ），产物借助常规电泳即可判定有无Ｋ－ｒａｓ基因突变及突变方式，无需酶切、杂交、放射性及非放射性显影等技术。研究发现：３１例胰腺癌标本有２３例存在Ｋ－ｒａｓ基因点突变，方式分别为ＣＧＴ、ＧＡＴ、ＧＴＴ，而９例正常胰腺组织、１９例胰腺良性疾病、７例胆管癌及４例十二指肠乳头癌均未见Ｋ－ｒａｓ基因突变。该法简便、快速、特异、灵敏，易临床推广应用，可以作为胰腺病变良恶性鉴别的一种新方法。