PCR-Targeting体系构建棒状链霉菌基因突变株

棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)可产生多种β-内酰胺类化合物,其中包括克拉维酸。利用聚合酶链式反应(PCR)-Targeting体系构建棒状链霉菌突变株是获得克拉维酸高产菌株的又一可行方法。采用该体系对棒状链霉菌的lat基因进行了敲除,获得了没有抗性标记的lat基因被敲除的突变株S.clavuligerus lat::scar,其克拉维酸产量是出发菌株的2.8倍。由于最终构建的突变株没有抗性标记,因此可以将该方法应用于突变棒状链霉菌的其他基因,实现用一种抗性标记突变同一菌株不同基因的目的,为链霉菌的基因突变提供了又一种有效的方法。

某肿瘤医院NGS、PCR实验室空调系统设计浅析

NGS、PCR实验室已成为医院建设的重要部分,而空调、通风系统的合理设计和布局对这两个实验室安全、稳定、高效的运行起到重要的作用。以某肿瘤医院实验室为例,对NGS、PCR实验室各区域平面布局作了简要介绍,并结合其使用要求,对室内参数、压力梯度、送风、排风系统等要求作了简要阐述。

一种恒温区切换的快速PCR热循环系统设计

概述PCR(Polymerase Chain Reaction),即聚合酶链式反应,是一种分子生物学技术,主要用于在体外大量扩增特定DNA片段。PCR仪器是利用PCR技术对特定DNA扩增的一种仪器设备,PCR技术的一个重要特点是其灵敏度高、特异性好。这意味着即使在样本中存在少量的病原体,也能被检测到,从而提高了诊断的准确性。传统PCR设备适用于需要进行大量DNA扩增和高通量检测的场合,但其反应过程相对复杂,检测耗时长,且可能存在污染风险。

基于Matlab/xPC Target的实时仿真系统研究

利用Matlab RTW和xPC Target提供的实时仿真功能,可以完成某些实物在回路中的仿真。采用该种方式与传统方式相比,具有系统组建方便,成本低,开发周期短等特点。主要讨论了其实现方式和开发流程,并将其应用到弹载计算机仿真评估系统的设计中。

实时荧光定量PCR构建奶牛生殖系统PrP基因标准品质粒和标准曲线

为阐释PrP基因在奶牛生殖系统的正常表达和正常的生理功能,以及为确定生殖系统在疯牛病垂直传播中的地位和其分子机理奠定基础,采用实时荧光定量RT-PCR的方法构建了奶牛生殖系统PrP基因的标准质粒和标准曲线。对含有目的基因质粒的EcoRⅠ酶切鉴定表明所插入的片段大小为302 bp,与预期的结果一致。所构建的标准曲线的相关系数r2=0.999,系统生成的回归方程为y=-0.29x+9.48,说明成功构建了奶牛生殖系统PrP基因的标准质粒和标准曲线,为研究PrP基因在奶牛其他组织的定量奠定基础。

PCR-DGGE法用于活性污泥系统中微生物群落结构变化的解析

应用PCR- DGGE方法,对在相同的操作条件下分别用低温菌和常温菌接种的两套活性污泥系统中的微生物群落结构的动态变化进行了追踪。研究结果表明:由于工艺和操作条件相同,两系统的微生物群落结构的相似性随着运行时间的增加而增加。PCR-

凡纳滨对虾海水养殖系统内细菌群落的PCR-DGGE分析

采用PCR-DGGE(PCR-denaturing gradient gel electrophoresis)技术对一个典型的凡纳滨对虾(Litopeneaus vannamei)海水养殖系统细菌群落进行分子分析。结果表明,沿岸水、蓄水池、养殖池水具有较高的细菌种类多样性,而蓄水池进水、对虾粪样、肠壁定植细菌样以及排水渠污水的细菌多样性程度低。每种环境群落的优势种明显。3个养殖池水样(Y1、Y2、Y3)、2个沿岸水样(W1、W2)、2个粪样(F1、F2)、蓄水池水样(B1、B2)及2个肠壁定植细菌样(G1、G2)各自具有高度群落相似性。BLAST结果表明,12个条带克隆序列所代表优势种很可能来源于以下几个属:柔发菌属(Flexithrix)、黏纤维菌属(Cytophaga)、Dyella属、聚球菌属(Synechococcus)、Chlorarachnion属、支原菌属(Mycoplasma)、草螺菌属(Herbaspirillum)、河氏菌属(Hahella)、Ruegeria属。本研究表明,PCR-DGGE技术可以用于海水对虾养殖系统的细菌群落结构分析。对于海水对虾养殖系统来说,一些序列所代表的主要细菌种类极有可能是很少被注意到或研究过的,具有潜在的研究价值。

采用PCR-RFLP和RAPD对球壳孢目真菌系统学的研究

对球壳孢目真菌首次采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ进行了系统发育研究。以ＩＴＳ１和ＩＴＳ４为引物对４属１２种２４个菌株的核糖体ＤＮＡ转录间区（ＩＴＳ）进行了ＰＣＲ扩增，４种内切酶（ＡｌｕＩ，Ｈｈａ，ＭｓｐＩ，ＴａｑＩ）酶切，结果表明：主要属的ＩＴＳ区长度不同，同属不同种相同。Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ，Ｐｈｙｌｏｓｔｉｃｔａ，Ａｓｃｏｃｈｙｔａ，ＳｅｐｔｏｒｉａＩＴＳ区长度分别为６３０，５６０，５５０，５４０ｂｐ；酶切图谱属间差别明显，属内种间基本一致，暗示传统的分种可能过细，某些种的成立还有商榷的余地，ＰＣＲ－ＲＦＬＰ对确定疑难种属的地位有重要的意义。３属８种１６个菌株的ＲＡＰＤ结果表明，种内图谱相同或图谱类型相同，而种间明显不同，揭示出过去所划分的种的确存在本质的差别。

自建HBV-DNA实时荧光定量PCR检测系统性能验证方法及结果分析

目的探讨自建乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)实时荧光定量PCR检测系统性能验证的方法和程序,充分了解其检测性能,评估并确认分析性能是否符合预期用途。方法参考美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)颁布的EP系列文件及中国合格评定国家认可委员会(CNAS)对实验室检测系统评估的要求,对实验室自建的HBV-DNA实时荧光定量PCR检测系统进行精密度、正确度、线性范围、检测下限等性能参数的验证和评价。结果 HBV-DNA定量检测低值和高值的批内精密度CV分别为3.4%和1.8%,总精密度CV分别为3.8%和1.8%。正确度初次验证有两项不符合要求,经厂家校准后重新验证符合要求。线性回归方程为Y=0.997X+0.012,R2=0.999,线性范围为500-108IU/ml。检测下限为500 IU/ml。结论自建HBV-DNA实时荧光定量PCR检测系统的性能符合要求,能够应用于临床检测。

基于xPC Target的直线电机快速原型控制系统

以嵌入式工业PC为控制器,配以模数转换板、数字量输出板、光栅尺接口板和驱动板,利用MATLAB的xPC Target工具箱搭建了直线电机快速原型控制系统,并在快速原型控制系统中实现了带有跟踪微分器的非线性PID控制算法。实验结果表明:这种基于xPC Target的直线电机快速原型控制系统能够直接采用Simulink中建立的控制算法,具有很高的灵活性;同时,直线电机控制系统采用带有跟踪微分器的非线性PID控制算法时具有很好的动静态特性和抗扰性。

应用荧光定量PCR验证干扰素诱导表达基因在系统性红斑狼疮患者中的表达

目的 应用荧光定量聚合酶链反应技术验证由基因芯片发现的干扰素 (IFN)诱导基因表达谱在系统性红斑狼疮 (SLE)、类风湿关节炎 (RA)和正常人中的表达。方法 测定 4 0例SLE患者、2 8例RA患者和2 9名正常人外周血白细胞Ly6e、IFIT1、OAS2IFNw、IFNa13表达 ,初步分析外周血分离出来的T、B及单核细胞中这些基因的表达。结果 与正常人相比 ,SLE组的Ly6e、IFIT1、OAS2基因表达显著增高 ,其中Ly6e、OAS2基因的表达较RA组也显著增高 ,但IFNw、IFNa13基因表达反而降低 .这组基因在单核细胞的表达最高。结论 IFN诱导的基因在SLE患者中呈高表达 。

七株微囊藻系统进化关系的RAPD-PCR分析(英文)

应用RAPD－PCR的方法，选用24个随机引物，分析来自不同地区的7株微囊藻的基因组多态性．结果显示，Microcystis．viridis及M.wesenbergii明显与M．aeruginosa区分开．M．aeruginosa分为两个可视为不同种的异源分类单位．作为对照的Anabaenasp．7120与其他微囊藻株表现出完全不同的基因型及更远的遗传距离．此项研究表明，以基因型而不是表现型为基础，分析蓝藻种内及种间区别是可能的．因此，为解决蓝藻分类问题，特别是在种和属的水平上，提供了重要的线索．结合正在进行的用特异性及准确性强的引物区分微囊藻产毒及非产毒株的方法，RAPD－PCR可望将微囊藻产毒及非产每株进化关系澄清．

高致病性猪繁殖与呼吸系统综合症病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为了对当前爆发流行的高致病性猪繁殖与呼吸系统综合症病毒建立快速准确的检测方法,根据该类病毒在Nsp2基因1594-1680处缺失87个碱基的特点,设计了一对特异性引物和一个Taqman探针,通过对反应条件的优化,建立了荧光定量PCR检测方法。该方法特异性强,灵敏度高,能很好地区分高致病性猪繁殖与呼吸系统综合症病毒和其它病毒,没有发现假阳性和假阴性现象,检测病毒滴度达到1TCID50。用该法对38份疑似样本进行检测,阳性率60.5%,与常规PCR检测法符合率100%。

基于LabVIEW的串口通信在PCR仪监控系统中的应用

基于LabVIEW7·0Express环境的串口通信,实现了上位监控软件对PCR反应过程的实时监控,一方面,上位机下发指令;控制PCR仪中的热循环模块的温度设定,步进电机的动作、激发光源的快关:另一方面,下位机上传数据,确认PRC仪当前运行状态、当前的反应度等。

PCR辅助转录滴定系统定量检测AFP mRNA方法的建立

目的 :建立 PCR辅助转录滴定系统 (PATTY)定量检测 AFP m RNA的方法。方法 :采用 RT- PCR定点替代突变及体外转录技术合成单碱基突变 AFP m RNA内竞争模板 ,以竞争性 RT- PCR定量检测各肝癌细胞株 AFP m RNA。结果 :成功制备引入 Hind 酶切位点的单碱基突变 AFP m RNA内竞争模板 ,建立 PATTY定量检测 AFP m RNA的方法 ;检测 1μgHep G2 和 Huh7两株肝癌细胞总 RNA中 AFP m RNA含量皆为 10 1 0 copy/ μg,PL C/ PRF/ 5细胞株为 10 7copy/ μg。 结论 :PATTY检测 AFP m RNA能同步监控待检靶 m RNA逆转录过程 ,扩增效率不受 PCR诸因素干扰 ,检测结果可靠 ,适合微量循环肝癌细胞相关 AFP m RNA的定量检测研究。

迟钝爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统基因的克隆及多重PCR检测方法的建立

采用PCR法扩增大菱鲆Scophthalmus maximus出血性败血症病原菌迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tardaL-49231菌株Ⅲ型分泌系统(TTSS)的装置蛋白(esaC)、效应蛋白(eseB、eseC、eseD)和调节蛋白(esrA、esrB)6种基因,并将其克隆到载体PMD19-T中分别进行测序;通过优化反应条件,建立一次检出效应蛋白eseB、eseC和eseD 3种基因片段的多重PCR方法;采用所建立的多重PCR方法检测迟钝爱德华氏菌不同菌株(L-49231、GhAn080310、GhAn080313和GhAn080314)、沙门氏菌Salmonella enterica、大肠杆菌Escherichia coli和肠杆菌Enterobacter中效应蛋白基因的存在情况。结果表明:L-49231菌株中存在esaC、eseB、eseC、eseD、esrA和esrB 6种基因片段,大小分别为837、184、934、445、464、458 bp,与GenBank中迟钝爱德华氏菌PPD130/91菌株的这6种基因的同源性分别为99%、97%、99%、99%、99%、98%;通过优化反应条件,在退火温度为54℃,基因eseB、eseC和eseD引物浓度(μmol/L)组合比为5∶10∶2,Mg2+浓度为1.5 mmol/L时,能够得到清晰、稳定且均一的多重PCR产物,并与目的条带分子量一致;采用所建立的多重PCR方法进行检测,迟钝爱德华氏菌L-49231菌株中存在eseB、eseC和eseD 3种基因片段,迟钝爱德华氏菌GhAn080310、GhAn080313、GhAn080314菌株中存在eseB和eseC基因片段,但未检出eseD基因片段;沙门氏菌、大肠杆菌和肠杆菌中均未检出eseB、eseC和eseD基因。表明所建立的多重PCR方法对迟钝爱德华氏菌具有较好的特异性,可检出具有Ⅲ型分泌系统效应蛋白的菌株。

PCR芯片控温系统研究

通过采用以单片机为核心的数字电路控温技术、PWM技术以及PID控温算法 ,研制出成本低、控温精度高。

荧光定量PCR技术在泌尿系统结核中的诊断价值

目的应用荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测泌尿系统结核患者尿液中(TB-DNA)的检出率,评估其对泌尿系统结核患者的诊断价值。方法选择泌尿系统患者66例,应用FQ-PCR技术检测患者尿液中TB-DNA的检出率,并与抗酸染色法的检出率比较。结果 66例泌尿系统疾病患者中,确诊泌尿系结核患者52例,TB-DNA阳性32例,32例全部确诊为泌尿系结核,特异度100%,抗酸染色阳性4例。结论应用FQ-PCR技术检测泌尿系统结核患者尿液中TB-DNA,具有高度敏感性和特异性,明显优于抗酸染色法。

黄瓜细菌性白枯病菌系统进化分析及PCR检测方法的建立

黄瓜细菌性白枯病是黄瓜生产上的重要细菌病害,通过病菌16S rDNA序列测定、相关序列比对、系统进化树构建及特异性引物设计研究,明确该病菌系统进化关系,建立PCR检测方法。经NCBI-BLASTn结果表明:黄瓜细菌性白枯病菌CU-PV 07菌株的16S rDNA基因序列与GenBank中的同种相关序列存在较少碱基的差异,同源性达到了99%。设计的引物P1/P2具有很强的特异性,PCR扩增后只有该病菌呈阳性。构建的PCR检测体系检测准确、灵敏度高,可用于此病害快速诊断。

新疆细毛羊2倍基因组BAC文库PCR筛选系统的构建与使用

本研究所构建的BAC文库覆盖了8倍新疆细毛羊的基因组，平均插入片段的大小为133kb．同时文库92．5％的克隆插入片段大于100kb，而且有部分克隆甚至大于300kb，假定绵羊的基因组含有3×10^6kb，根据文库的平均插入片段大小为133kb，从文库筛选到目的片段的概率为98．208％。为了验证文库有较好的覆盖率．构建了2倍基因组文库PCR筛选系统，并对位于新疆细毛羊20号染色体MHC基因邻近区段的DMB_EX2、MCMA36、CP73和BM12584个分子标记进行了筛选．得到的平均阳性克隆数为1．5个，从筛选结果来看，这与文库插入片段估计的8倍基因组覆盖率相当接近并且没有偏向，这使得本文库成为研究绵羊的功能基因、位置克隆和完善基因组物理图谱的极为有用的资源。