一种PCR产物克隆零背景T载体的构建

为解决平末端加T法构建的T载体,在PCR产物克隆时连接效率低、阳性克隆筛选困难的问题,本研究在利用Taq DNA聚合酶末端转移酶活性对线性化平末端pBluescript SK(+)载体3′-端进行加T反应后,使用T4DNA连接酶处理加T后pBS载体,使3′-端未加T平末端载体重新形成超螺旋状态,而3′-端加T载体则保持线性化状态,在琼脂糖电泳时切胶回收3 000bp处DNA片段,成为pBS-T载体。使用构建的pBS-T载体分别克隆500bp和1 000bp PCR片段,pBS-T载体克隆效率达到100%,实现了对PCR产物的零背景克隆。

一种简便、通用的PCR产物克隆系统

目前应用PCR技术扩增目的基因进而得到克隆化基因的方法已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。尽管在引物两端引入限制性内切酶识别位点定向高效地克隆目的基因这一设计思路极富魅力,但在实践这个思路的过程中经常遇到困难,其主要原因是由于当多种限制性内切酶的识别序列位于DNA片段的两端时,其酶切效率变得很低。

一种基于核酸外切酶Ⅲ的PCR产物克隆方法

基因克隆作为一种常规技术被广泛应用于DNA及蛋白质的研究。在传统的基因克隆中,一般利用限制性内切酶对DNA片段进行消化,然后使用DNA连接酶完成连接,因此这种方法受到插入片段和载体酶切位点的限制。一些ligase-free克隆技术虽然克服了酶切位点的限制,但费时费力,成本较高。为了弥补其他ligase-free技术的不足,文中介绍了一种新的利用核酸外切酶Ⅲ进行ligase-free克隆的方法,反应时间仅需要30 min,提高了克隆效率并有效降低经济成本,有利于大规模基因克隆的应用。

桫椤atpB-rbcL序列2种测序方法的比较分析

[目的]比较2种方法进行桫椤atpB-rbcL序列测定的测序效果。[方法]通过PCR产物直接测序和克隆测序对桫椤叶绿体atpB-rbcL基因间隔序列进行测定与分析。[结果]结果表明,桫椤atpB-rbcL序列直接测序所得峰形紊乱,PolyT后出现多重峰;克隆测序结果峰形清晰,无干扰。[结论]对于桫椤atpB-rbcL序列测定,克隆测序优于直接测序。