雀形目38种鸟类线粒体cytb的引物设计及PCR优化

通过设计雀形目鸟类线粒体细胞色素b的通用引物并对其PCR反应体系进行优化,确定了雀形目38种鸟由基因组DNA扩增线粒体细胞色素b基因全序列的最佳反应条件.在10μl最佳反应体系中,dNTP浓度为100μM,引物浓度100nM,退火温度范围为51～55℃,模板量在50～150 ng之间,扩增反应效果最好.在上述最佳反应体系和条件下获得的目的条带清晰、明亮,可应用于雀形目鸟类分子系统学研究.

决明DNA提取、SRAP-PCR优化及引物筛选

以决明幼叶为试验材料,对6种DNA提取方法进行比较,并通过单因子梯度比较试验,对SRAPPCR扩增体系中DNA和引物浓度进行优化,在此基础上再对引物进行筛选,随后对不同方法提取的DNA运用优化的SRAP-PCR体系再次进行扩增验证。结果表明改良CTAB法是决明DNA提取的最佳方法;20μL的SRAP-PCR体系中模板最佳质量浓度为2.5mg/L,引物浓度为0.4μmol/L;运用优化体系从180对引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物72对。

RAPD-PCR系统优化用于对水稻穗型性状的分析

本实验优化了RAPD-PCR体系,并用于对重组自交系F_(12)群体中随机挑选直穗水稻和弯穗材料进行分析。结果表明,优化的RAPD-PCR体系可用于多态性分析,从100条随机引物中筛选到7条对模板DNA扩增出了具有重复性较好、清晰、稳定、多态性高的谱带,优化后的RAPD-PCR系统可望应用于对直穗和弯穗这一对性状的分析。

小麦族拟鹅观草属Adh基因PCR扩增条件优化

拟开发适用于小麦族拟鹅观草属植物系统发育研究的低拷贝核基因,即Adh基因。通过探索模板DNA、Mg2+、dNTP和引物的浓度,以及退火温度等因素对Adh基因扩增的影响,建立最优PCR体系。在25μL最优PCR反应体系中包括如下成分:2.5μL10×PCR缓冲液,0.6μL模板DNA(约15ng),1.5mmolMg2+,0.15mmoldNTP混合液,0.12μmol正向和反向引物,0.75UExTaq酶;退火温度为55℃。优化后的体系得到清晰目的条带,可用于后续研究。

龙眼SCoT-PCR反应体系的优化

目标起始密码子多态（start condon tardeted polymorphism,SCoT）分子标记结合了ISSR标记和RAPD标记的优点,具有操作简单﹑成本低廉﹑多态性丰富﹑重复性好﹑引物设计简单且通用性良好等诸多优点。本实验以石硖龙眼的新鲜叶片为试材,采用单因素试验的方法分别研究模版、引物、rTaqDNA聚合酶、dNTPs、缓冲液（Mg2＋）及退火温度共6因素各8个水平对龙眼SCoT-PCR扩增结果的影响。结果表明：龙眼SCoT标记的20μL优化反应体系为：10×BufferⅡ（含Mg2＋）2.0μL、DNA模板30ng、引物浓度为30μmol/L、rTaqD-NA聚合酶用量为0.45U、dNTP浓度为4.0mmol/L。适宜的扩增程序为：94℃预变性4min;95℃变性50s,49.5℃退火40s,72℃复性2min,36个循环;最后72℃延伸10min。利用24个龙眼品种验证该反应体系,1.5%琼脂糖电泳检测结果显示,扩增产物在400-2200bp之间,不同品种间DNA谱带具有多态性,反应体系具有良好的稳定性和可重复性。

伯乐树cpDNA-PCR反应体系的优化与引物筛选

伯乐树为国家一级保护植物,在研究被子植物的系统发育和古地理、古气候等方面具有重要的科学价值。cpDNA-PCR反应是在分子水平上确定伯乐树系统分类的基础。建立了伯乐树cpDNA-PCR反应体系,对影响扩增反应的因素(Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度以及模板DNA浓度)进行了优化,得到了伯乐树cpDNA-PCR扩增反应的最佳体系,并筛选出了适合伯乐树分子谱系地理研究的非编码区序列和引物。伯乐树cpDNA-PCR最佳反应体系为:30μL反应体系含有10×PCR buffer、2.9 mmol Mg2+、120 mmol dNTP、上下游引物各11μmol、DNA模版30 ng以及3个单位的Taq酶。适合于伯乐树分子谱系地理学研究的3对引物及其退火温度为PipetB1411F-PipetD738R(52℃)、psbA-trnHGUG(59℃)、trnL-trnF(56℃)。

水稻PCR反应体系的正交设计优化及验证(英文)

[目的]筛选经济、稳定性好的水稻PCR反应体系,并检测所选体系在不同的基于PCR反应的分子标记中的通用性。[方法]以CTAB法提取的水稻叶片DNA为模板,应用L16(45)正交设计进行PCR反应体系优化。选用20μl体系的浓度梯度设计,对DNA模板浓度、dNTP、引物浓度、Taq酶、Mg2+浓度5个因素设计4个水平。先以1个SSR标记(MRG6102)对16个不同体系进行筛选。为了验证所选最优体系的稳定性,再选用6个SSR标记(RM213、RM207、RM208、RM155、OSM89、OSM91)对20个水稻品种(系)进行扩增;为检测除SSR标记以外的基于PCR反应标记的通用性,选用2个STS标记(OSR20、OSR32)及2个显性标记(Pibdom,Lys145)进行检测。[结果]16个不同处理组合均扩增出了清晰谱带,但扩增效果及PCR产量有差异。最经济、适用的体系为:20μl反应体系,20ng模板DNA,浓度150μmol/LdNTP,浓度0.2μmol/L引物,1.0UTaqDNA聚合酶,浓度1.5mmol/LMg2+,1×Taqbuffer,剩余体积用超纯水补齐。PCR扩增程序为:95℃预变性3min;94℃变性45s,48～55℃退火45s(不同的引物其最佳退火温度不同),72℃延伸1min(对于其他一些基于PCR反应的标记,如果预期片段较大,可以适当调整延伸时间到1.5min),共36个循环;72℃延伸7min;然后4℃保存。[结论]该研究确定了水稻PCR优化反应体系,该体系也适用于一些其他基于PCR反应的标记。

单头赤眼蜂DNA提取方法比较及其PCR反应体系优化

为了探明有效的基因组DNA提取方法和PCR反应体系,从而得到符合分子生物学实验要求的基因组DNA模板的数量和质量,以单头松毛虫赤眼蜂为材料,应用CTAB法、SDS法和Chelex法进行基因组DNA提取效果的比较,并将核酸助沉剂用于赤眼蜂DNA的提取中,然后将提取的基因组DNA采用L16(45)正交设计试验,对影响赤眼蜂基因组DNA PCR反应体系的5因素(Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、DNA模板、Taq聚合酶)4水平进行筛选。结果表明:CTAB法优于SDS法和Chelex法,且核酸助沉剂的加入明显增强了模板DNA提取效果。同时确立的ITS2的PCR优化反应体系为:总体积为25mL,Mg2+浓度为1.50mM,dNTPs浓度为0.25mM,引物浓度为0.30μM,DNA模板取2.00μL,Taq聚合酶量为2.00U。

正交设计优化山野豌豆SRAP-PCR反应体系与引物筛选

采用正交试验设计,以山野豌豆叶片DNA为模板,从Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶4种因素3个水平,对山野豌豆SRAP-PCR反应体系进行优化,并比较了不同浓度模板DNA对扩增效果的影响,建立了山野豌豆的SRAP-PCR最佳反应体系。结果表明,山野豌豆SRAP-PCR最佳反应体系为:2μL 10×PCR buffer(不含Mg2+)、30ng的模板DNA、引物2.0μmol/L、Mg2+2.0mmol/L、Taq DNA聚合酶1.5U、dNTP 0.2mmol/L,总体积为25μL。各因素对扩增反应结果均有不同影响,其中以引物浓度影响最大,dNTP浓度的影响最小。运用该体系对3份山野豌豆种源进行验证,证明该体系稳定可靠,并从98对SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的20对引物组合。这一体系的建立及多态性引物组合的筛选为SRAP分子标记技术进行山野豌豆分子遗传学研究奠定了基础。

樟树ISSR-PCR反应体系优化研究

以樟树基因组DNA为材料,分析了影响樟树ISSR-PCR的主要参数,确立了适用于樟树的ISSR反应体系和扩增条件。结果表明获得清晰、重复性高的樟树ISSR-PCR扩增条件为:20μL PCR反应体积中,1×PCR Buffer(10 mmol.L-1Tris.HCl,pH8.3,50 mmo.lL-1KCl),2.0 mmo.lL-1MgCl2,200μmol.L-1dNTPs,50 ng模板DNA,200 nmo.lL-1引物,0.5 UTaq DNA聚合酶。在扩增过程中,引物的适宜退火温度比其Tm值平均高3℃。这为今后利用ISSR标记技术开展樟树种间遗传多样性分析提供参考。

水稻PCR反应体系的正交设计优化及验证

[目的]筛选经济、稳定性好的水稻PCR反应体系,并检测所选体系在不同的基于PCR反应的分子标记中的通用性。[方法]以CTAB法提取的水稻叶片DNA为模板,应用L16(45)正交设计进行PCR反应体系优化。[结果]16个不同处理组合均扩增出了清晰谱带,但扩增效果及PCR产量有差异。最经济、适用的体系:20μl反应体系,20ng模板DNA,浓度150μmol/LdNTP,浓度0.2μmol/L引物,1.0UTaqDNA聚合酶,浓度1.5mmol/LMg2+,1×Taqbuffer,剩余体积用超纯水补齐。[结论]试验确定了水稻PCR优化反应体系,该体系也适用于一些其他基于PCR反应的标记。

新疆野苹果S基因特异性PCR体系优化

【目的】构建适合新疆野苹果自交不亲和基因的PCR扩增程序的优化体系。【方法】采用单因素比较试验,对影响S-RNase基因PCR反应体系的6个主要因素进行梯度扩增。【结果】在20μL的PCR总反应体系中,Mg2+的最适浓度为2.5 mmol/L,dNTP的最适浓度为0.2 mmol/L,引物的最适浓度为0.5 mmol/L,TaqDNA聚合酶的最适用量为0.75 U,模板DNA的最适用量为800 ng,最适退火温度为49℃。【结论】利用优化的扩增体系在99个新疆野苹果都获得了有效扩增,证明该体系为进行新疆野苹果S基因PCR扩增的最佳体系,具有良好的稳定性。

补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR条件优化

目的对补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系及扩增程序进行优化,检测PCR优化体系的适用性和灵敏性。方法通过改进引物设计、改变PCR反应过程中Mg2+浓度、引物浓度、退火温度、模板DNA浓度及反应循环次数,分析比较PCR扩增效果。结果优化后的补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系中,Mg2+浓度在2-4mmol/L,引物浓度在0.025-0.4μmol/L,循环次数在30-45次之间均能扩增得到清晰均一的特异性条带;同时,引物退火温度在55.5℃-69.6℃范围内均适用;优化后PCR体系能够检测的最低DNA浓度为1.41ng/μl,即模板DNA在反应体系中的总量为约2.82ng.结论已经建立的优化后的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。

HBVC区基因克隆和PCR条件优化

目的建立PCR优化条件和方法,探讨HBVC区基因在乙型肝炎PCR检测中的应用价值,为荧光定量PCR检测HBV摸索条件。方法将HBV基因组导入DH5α大肠杆菌,SDS碱裂解法小量提取大肠杆菌阳性构建质粒DNA,设计合适引物对HBVC区基因进行PCR扩增,对PCR条件中的退火温度、Mg2+浓度进行了优化,并比较三种不同Taq DNA聚合酶的灵敏度。结果转化的大肠杆菌质粒DNA最佳退火温度为58℃,最佳Mg2+浓度为1.5mM,同时确定天源公司的Biostar Taq DNA聚合酶灵敏度最高,扩增到10-6。结论确立了HBVC区PCR的优化条件,将为后期进行荧光定量PCR检测HBV感染奠定基础以及为探索更有效的检测方法提供实验依据。

快速微量提取番茄DNA及SSR-PCR反应体系的优化

以番茄叶片为试材,采用改进的CTAB法,电钻研磨,提取过程中加入醋酸铜,设计4因素3水平的正交试验对PCR反应体系进行优化,同时利用梯度PCR对退火温度进行选择选择。结果表明:优化的10μL反应体系含:1×buffer,1.2 mmol/L Mg2+,1.5 mmol/L dNTPs,1.2μmol/L引物,0.75 UTaqDNA聚合酶,10 ng模板DNA。扩增程序为:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,49.2℃退火30 s,68℃延伸30 s,共35个循环;最后72℃延伸8 min。优化的反应体系可以用于SSR分子标记机的研究,在所有SSR引物中基本都能有效扩增;改进的CTAB法提取的DNA纯度更高。

苹果炭疽菌DNA改良提取法及PCR体系的优化

以苹果炭疽病胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)为试材,采用改良的SDS法、改良的CTAB法和改良的尿素法等对基因组DNA进行了提取和比较,并对ITS1-5.8S-ITS2区基因PCR扩增体系中模板的添加量以及退火温度进行了调整和优化。结果表明:采用这3种方法均能提取得到目的 DNA,但采用改良的SDS法提取的基因组DNA产率最高、质量最好;当在25μL PCR体系中添加0.75μL粗提DNA 10倍稀释液以及退火温度设定为51℃时PCR产物的质量最高。

结核分枝杆菌的优化PCR检测方法的研究

〔目的〕的建立了检测结核分枝杆菌的高灵敏度和高特异性PCR扩增体系。[方法]以国内结核病人常见病原菌-结核分枝杆菌、牛分枝杆菌特异性抗原Pab编码基因上的419bp段作为扩增靶序列,扩增引物序列为5’-ACC、ACC、GAG、CGG、TTC、CCC、TGA-3’、5’-GAT、CTG、CCG、GTC、GTC、CCA、GGT-3’。〔结果〕变性温度选择69℃-70℃。PCR扩增体系的成份经优化,选择引物浓度为0.30μmol/L,dNTP浓度为150μmol/L,MgC12浓度为3.5mmol/L。〔结果〕该体系对11株标准菌株和12株临床分离菌株提纯的染色体进行扩增,其中卡介苗、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌的扩增为阳性,其他分枝杆菌为阴性。〔结论〕以提纯的染色体DNA作模板,该体系可检出5fg结核杆菌染色体DNA,相当于一个结核分枝杆菌。

湿地松、加勒比松及其杂交种DNA的提取与微卫星PCR反应体系的优化

文章归纳总结了湿地松、加勒比松及其杂交种湿加松DNA提取的操作流程及其质量检测等方法,并就湿加松的微卫星PCR反应体系的优化问题,进行了一系列的试验,包括Mg2+浓度的梯度试验、不同退火温度和不同循环次数下的扩增试验。试验结果表明,用CTAB法在冰浴下研磨就可以得到质量较好的 DNA用于PCR扩增;PCR的最优反应体系使用20μl的反应体积,2．0 mM镁离子浓度,经30个循环后可扩增出较好的谱带。

利用二次正交旋转组合设计优化木瓜SRAP-PCR反应体系

以木瓜属(Chaenomeles)植物基因组DNA为模板,采用五因素二次正交旋转组合设计(实施),对PCR反应的5个因素(Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA)进行研究,首次建立了PCR反应的各因素编码值与PCR结果评分值之间的数学模型。利用该模型,建立了PCR反应的最优体系,并进行了验证。最优体系的成功建立表明,该优化方法是稳定可靠的,可以为其他物种的PCR体系优化提供借鉴。

叶子花SSR-PCR体系的优化

[目的]优化叶子花SSR-PCR体系。[方法]以乔木叶子花为材料,通过Touchdown PCR扩增程序和正交试验,对影响叶子花SSR-PCR体系的引物浓度、Taq DNA聚合酶用量、Mg2+浓度和d NTPs浓度进行优化。[结果]叶子花20μl SSR-PCR体系的最优条件为引物浓度0.4 mmol/L、Taq DNA聚合酶用量1.5 U、Mg2+浓度1.5 mmol/L、4种d NTPs浓度均为0.15 mmol/L,模板100 ng左右。[结论]该反应体系的扩增条带清晰、稳定、重复性好,可用于后续叶子花遗传多样性分析和种质资源鉴定等研究。