日本血吸虫(中国大陆株)Sj16基因的体外扩增及克隆

为了构建日本血吸虫（中国大陆株）Ｓｊｌ６基因原核表达重组质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－Ｓｊ１６。根据曼氏血吸虫Ｓｍ１６基因已知序列设计合成一对引物．用 ＰＣＲ技术从日本血吸虫（中国大陆株）成虫ｃＤＮＡ文库中扩增 Ｓｊ１６基因；将Ｓｊ１６基因定向克隆人 ＰＧＥＸ－４Ｔ－１，转化感受态 ＢＬ２１／ＤＥ３菌；用酶切、ＰＣＲ扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆。结果表明，从日本血吸虫（中国大陆株）成虫ＣＤＮＡ文库中获取Ｓｊ１６基因，重组质粒中含有Ｓｊ１６基因。结果提示，成功构建日本血吸虫（中国大陆株）Ｓｊ１６基因原核表达重组质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｓｊ１６，为进一步研究Ｓｊ１６基因功能打下基础。

恶性疟原虫FCC1/HN株Pf12基因体外扩增、克隆及序列分析

目的 构建恶性疟原虫FCC1/HN株Pf12基因原核表达质粒pET2 8α -Pf12 ,测定Pf12基因序列 ,并为FCC1/HN株Pf12的体外表达奠定基础。方法 采用PCR技术从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中扩增出Pf12基因 ,扩增产物经纯化后 ,用BamHI +XhoI双酶切 ,定向克隆入pET2 8α质粒 ,转化大肠杆菌DH5α,再用BamHI +XhoI酶切及PCR扩增对重组子进行鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定 ,并应用PCGENE软件进行同源性比较及预测抗原表位。结果 筛选出编码FCC1/HN株Pf12基因的原核表达质粒 pET2 8α -Pf12 ,FCC1/HN株Pf12基因序列与FMG株高度同源 ,Pf12基因序列中可能存在抗原表位。 结论 pET2 8α-Pf12重组质粒的构建 ,为恶性疟原虫FCC1/HN株Pf12基因的体外表达奠定基础。

肿瘤转移抑制基因nm23-H1和nm23-H2特异性片段的体外扩增、克隆和鉴定

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ），从人基因组ＤＮＡ中扩增出ｎｍ２３－Ｈ１（１８５ｂｐ）和ｎｍ２３－Ｈ２（１４５ｂｐ）特异性ＤＮＡ片段，与载体ｐＧＥＭ－３ｚｆ（＋）平端连接，重组质粒分别转化宿主菌ＪＭ１０９，在含Ｘ－ｇａｌ和ＩＰＴＧ的平板上直接筛选阳性克隆，限制性内切酶谱分析及ＰＣＲ扩增鉴定，确定ｐＧＥＭ－Ｈ１和ｐＧＥＭ－Ｈ２重组体。为ｎｍ２３基因与肿瘤转移研究打下基础。

应用二次PCR技术提高体外基因扩增的效率

自1985年Mullis等创立PCR技术以来,作为一种基因研究的新方法,在传染病、遗传病、肿瘤及基因工程的诊断和研究等许多领域内得到广泛应用,是分子生物学研究技术的重大突破.PCR方法灵敏、特异、简便、快速,但实验受诸多因素的影响,可以造成非特异性扩增产物或扩增产物的产量不足等,使实验达不到预期结果.为此我们建立了PCR二次扩增方法,弥补了第一次扩增有时出现的缺陷,提高了扩增效率.

人β-NGF基因的体外扩增、克隆及其序列的分析

目的 对人β－ ＮＧＦ基因进行体外扩增和克隆及其序列分析，为其在真核细胞中的表达及其临床应用打下基础。方法 本实验设计并合成一对特异性引物，采用聚合酶链反应分别从人脑ｃＤＮＡ 和人睾丸ｃＤＮＡ 以及人脑基因组ＤＮＡ中扩增出β－ 神经生长因子（β－ ＮＧＦ）基因，并和Ｔ４ 载体相连接，经筛选得到人β－ ＮＧＦ克隆，并用Ｓａｎｇｅｒ 双脱氧末端终止法进行序列分析。结果 凝胶电泳显示在预期的位置出现阳性条带。

抗人小细胞肺癌单抗4B3重、轻链可变区基因的体外扩增、克隆和序列分析

目的 获得抗人小细胞肺癌单抗 4B3的重 ,轻链可变区基因。方法 根据小鼠免疫球蛋白可变区骨架区的保守序列分别设计了 4B3单抗重 ,轻链的可变区基因体外扩增的两对引物 ,从体外培养的 4B3杂交瘤细胞中提取总RNA ,反转录成cD NA ,以cDNA为模板 ,分别用设计的两对引物进行PCR扩增 ,扩增出的重 ,轻链基因片段 ,分别插入载体 pT Adv中 ,筛选出阳性克隆 ,并测序、分析。结果 重链可变区基因全长 345bp ,编码 115个氨基酸 ,轻链可变区基因全长 315bp ,编码 10 5个氨基酸。结论 上述研究为 4B3单抗的进一步改造和利用提供了实验基础。

抗马铃薯晚疫病质粒的分子克隆及其体外PCR扩增

从一株假单胞菌中分离其质粒DNA ,并将其转化到大肠杆菌DH5α中。通过晚疫病抑菌实验证明此菌对马铃薯晚疫病有很强的抑制作用 ,对该质粒进行纯化和限制性酶切位点分析后 ,将此质粒重组到含有绿色发光蛋白基因的质粒载体中。

野外采集标本中人埃立克体16S rRNA基因扩增方法及应用

本文应用特异引物 ,通过多对半巢式PCR从采自内蒙古大兴安岭的蜱标本中扩增出人粒细胞埃立克体和查菲埃立克体的 16SrRNA全基因 ,一方面提供了这 2种埃立克体存在于中国的证据 ,另一方面为今后进行埃立克体病的病原、媒介和宿主的调查研究提供了一个可行的方法。并从一只大林姬鼠的脏器中检测到EC

IL-11基因修饰的基质细胞对造血细胞体外扩增的影响

目的 研究造血因子白介素 11(IL 11)基因修饰的基质细胞对造血细胞体外扩增的影响。方法 采用逆转录病毒载体将IL 11基因转入基质细胞HFCL ,用Northernblot检测基质细胞HFCLIL 11基因的表达 ,用流式细胞仪检测IL 11基因修饰的HFCL支持的脐血CD3 4 + 造血细胞体外扩增中表型为CD3 4 + CD3 8- 早期祖细胞和表型为CD3 4 + CD41+ 巨核系定向祖细胞的比例。结果 基质细胞HFCL能够表达逆转录病毒介导的IL 11基因 ,并且在这种IL 11基因修饰的基质细胞支持下 ,脐血CD3 4 + 造血细胞经过7d扩增 ,扩增细胞中表型为CD3 4 + CD3 8- 的早期祖细胞和表型为CD3 4 + CD41+ 巨核系祖细胞的比例分别为 (1.62± 0 .2 3 ) %、(9.9±1.1) % ,高于未转基因HFCL的 (0 .8± 0 .2 3 ) %、(6.5± 1.8) % ,而在相同条件下细胞因子支持的扩增细胞中则分别为 (0 .19±0 .14 ) %、(6.0± 1.1) %。结论 基质细胞能够表达经逆转录病毒载体介导的IL 11基因 ,而且经IL 11基因修饰的基质细胞能显著促进CD3 4 + CD3 8- 的早期祖细胞和CD3 4 + CD41+ 巨核系祖细胞扩增。

脐血CD34^+细胞体外扩增时HOXB4基因表达的变化

同源盒基因家族成员HOXB4反映原始造血干/祖细胞(PHSC/PHPC)的自我更新和增殖能力。本研究采用实时定量RT-PCR的方法在mRNA水平上检测HOXB4基因的表达,以观察体外扩增脐血CD34+细胞自我更新的水平。结果显示:随着体外培养时间的延长,虽然CD34+细胞数增加,但HOXB4表达下降;周后,HOXB4几乎检测不到,与成熟外周血淋巴细胞表达HOXB4的水平相同;CD34+细胞与骨髓间充质干细胞(BM-MSC)共培养可以减缓CD34+细胞HOXB4表达的下降。结论:脐血CD34+细胞体外扩增过程中自我更新能力逐渐下降。CD34+与BM-MSC共培养有助于减缓体外扩增的CD34+细胞自我更新能力的丧失。

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（POP2）基因真核表达重组质粒。方法 根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRI、SalI酶切位点,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-1质粒,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2,而后经EcoR I、Not I双酶切出ROP2基因片段,再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2,为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。

弓形虫RH株SAG1基因序列体外扩增及生物信息学分析

根据SAG1基因序列,自行设计一对寡核苷酸引物,利用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中成功扩增出编码SAG1抗原的基因片段,扩增出的基因片段大小与预期长度(1006bp)相符,结果经测序验证,并利用生物信息学方法对SAG1蛋白理化性质、结构和功能进行了预测.

人骨髓基质干细胞克隆对脐血造血干细胞体外扩增作用的研究

探讨人骨髓基质干细胞的克隆化培养及其对体外造血干细胞扩增的影响。方法 :取正常肋骨分离骨髓 ,制备单个核细胞贴壁培养 ,约 5d后取集落样生长的梭形细胞扩增培养、传代。将分选的脐血造血干 /祖细胞接种到克隆培养的人骨髓基质干细胞及其他培养条件液上 ,比较不同培养条件及不同代次骨髓基质干细胞对造血干 /祖细胞扩增能力及集落形成能力的影响。结果 :人骨髓基质干细胞能扩增达 2 0代以上 ,经流式细胞仪检测证实为基质干细胞 ,单纯细胞因子组和细胞因子加基质干细胞组能有效扩增造血细胞 ,而后者有维持长期造血的作用。结论 :该克隆培养方法能有效扩增骨髓基质干细胞 ,培养的细胞有体外支持长期造血的作用。

伪狂犬病病毒HS株tk基因的PCR扩增与克隆

参照伪狂犬病病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ，ＰＲＶ）ＮＩＡ－３株ｔｋ基因序列，设计并合成１对长２２ｍｅｒ的引物，引物间距１．５ｋｂ，其内包含完整的ＰＲＶｔｋ基因。以ＢＨＫ２１细胞繁殖的ＰＲＶ湖北地方强毒株（ＨＳ－９３０４）基因组为模板进行ＰＣＲ扩增。琼脂糖凝胶电泳检测显示扩增主带清晰，长约１．５ｋｂ，符合设计要求。扩增片段克隆至由ｐＵＣ１８质粒改制而成的Ｔ载体中，限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＳｍａⅠ、ＸｈｏⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切分析证实，扩增片段的酶切位点与ｔｋ基因一致，说明扩增和克隆片段包含ＰＲＶｔｋ基因。

骨髓基质细胞对人造血CD_34^+细胞体外扩增及基因转导的作用

目的：探讨造血基质细胞对人外周血干细胞体外培养扩增及基因转导的促进作用。方法：应用基质细胞支持培养扩增体系进行人造血干细胞体外培养扩增及基因转导。结果：骨髓基质细胞和造血生长因子共同支持组的造血ＣＤ＋３４细胞在体外培养３周后，其造血祖克隆形成能力较单纯造血生长因子支持组高３０．７％（Ｐ＜０．０５）。在有基质细胞支持时，逆转录病毒载体上清转导人造血ＣＤ＋３４细胞后，其造血细胞克隆中Ｎｅｏ基因阳性克隆是无基质支持对照组的２倍。结论：基质细胞的支持有维持造血干细胞原始造血活性及促进基因转导的双重好处。

鸡源致病性大肠杆菌1型菌毛pilA基因的PCR扩增、克隆及序列分析

研究选择从四川规模化鸡场分离鉴定的5株优势血清型鸡源致病性大肠杆菌代表株(O89,O119,O141,O127)的1型菌毛pilA基因的PCR扩增片段分别定向克隆到pUC18质粒的多克隆位点,并转化到DH5α株大肠杆菌载体菌中,对目的基因的序列测定结果表明:5个克隆片段均含有1型菌毛pilA基因的全序列,全长459bp,编码信号肽和结构蛋白。用生物软件(DNASTAR)对9株大肠杆菌1型菌毛pilA基因序列、氨基酸序列、菌毛蛋白质二级结构预测及抗原性进行了分析比较,结果显示:鸡源致病性大肠杆菌1型菌毛间具有同源性,1型菌毛间存在一定的相同抗原位点。

鸡贫血病毒衣壳蛋白基因的PCR扩增和克隆

通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增鸡贫血病毒（ＣＡＶ）衣壳蛋白基因（１．４ｋｂ），并将此基因克隆进ｐＵＣ－１８载体中。通过原位杂交、酶切分析、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交及其标记成探针对ＣＡＶ基因组的特异性反应等试验证实所获得的克隆是含有ＣＡＶ衣壳蛋白基因的重组质粒克隆。

破伤风毒素全基因片段PCR扩增、克隆和序列分析

目的 对破伤风毒素全基因片段扩增、克隆和测序,以便有效利用。方法 根据A、B、C3个片段的基因序列,分别设计上游和下游引物,采用PCR扩增,并克隆3个片段,进行序列测定。结果 所克隆的基因（AF389424）与GenBank中的基因序列比较变异较小,C片段基因与国内克隆株AF154828相同。结论 为进一步研究、利用奠定基础。

白纹伊蚊防御素基因的体外扩增及鉴定

目的 克隆白纹伊蚊的防御素基因并对其进行序列分析。 方法 提取白纹伊蚊基因组DNA ,根据埃及伊蚊防御素基因序列设计合成引物 ,PCR产物克隆到T载体中进行测序和分析。 结果 从白纹伊蚊基因组DNA中扩增出了约 375bp的片段 ,PCR产物经测序后与已发表的埃及伊蚊防御素基因比较 ,具有很高的同源性。 结论 克隆了白纹伊蚊的防御素基因 。