金纳米颗粒与镁离子在自配PCR体系中的协同作用

聚合酶链式反应(PCR)因其高灵敏度及操作便捷,已广泛应用于医疗、医药和生物科学等领域,成为这些领域的关键技术。提高PCR反应的特异性一直是科研中的重要研究方向。传统上,镁离子在PCR中被视为辅酶,而我们研究发现:适当浓度的镁离子能显著增强PCR的扩增效果,进而提高反应特异性。除金属离子外,我们还探索了金纳米颗粒(AuNPs)对PCR的作用。由于在制备AuNPs的过程中,使用的柠檬酸根与体系中的镁离子易形成柠檬酸镁盐,这样就会降低带负电的DNA与AuNPs间的排斥力,从而增强了AuNPs与DNA的稳定结合。这一机制促使dNTP与单链DNA更有效的结合,从而提高PCR的特异性和产量。此研究为镁离子和AuNPs在DNA体外复制中的应用提供了新思路,并为提高PCR的特异性和产量提供了实验依据。

水稻抗稻瘟病基因Pi-ta和Pi-b多重PCR体系的构建与应用

稻瘟病是我国水稻主产区的重要病害之一,其主效抗性基因Pi-ta和Pi-b在我国很多稻区表现广谱持久的稻瘟病抗性,被广泛应用于我国的水稻育种和生产。本研究选用稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b及其等位基因的功能标记,在对22份分别已知抗病基因Pi-ta和Pi-b以及感病基因pi-ta与pi-b组成的水稻品种检测验证基础上,建立了2套稻瘟病基因多重PCR体系:体系I同时检测抗病基因Pi-ta与Pi-b,体系II同时检测感病基因pi-ta与pi-b,并利用2套体系对336份高世代育种材料进行检测,与单标记检测结果比较,表现稳定可靠,重复性好。本研究构建的抗稻瘟病基因分子标记多重PCR体系可用于水稻种质资源的快速评价和抗稻瘟病分子标记辅助育种。

强筋小麦分子标记多重PCR体系的构建与应用

面筋强度与小麦高低分子量谷蛋白亚基种类(组合)密切相关。以12个已知亚基基因组成的品种为对照,选用基因(位点)Axnull、Bx7OE、Dx5、Glu-A3d、Glu-B3i和Glu-B3的标记,构建多重PCR体系。以该体系检测对照的结果与已知基因型完全一致,一次PCR可同时间接检测7个与强筋有关基因(位点)Ax1/Ax2*、Bx7OE、Dx5、Glu-A3d、Glu-B3i和Glu-B3。对62个陕西小麦品种的检测结果表明,优质强筋亚基基因(位点)Ax1/Ax2*、Dx5、Glu-A3d、Glu-B3i和Glu-B3的比例依次为56.5%、9.6%、33.9%、1.6%和64.4%,所有品种均不含Bx7OE,携带0、1、2和3个及以上基因(位点)的品种分别占6.5%、33.9%、48.3%和11.3%。说明聚合多个强筋亚基基因(位点)的品种频率较低,通过优质亚基基因的聚合育种,可望改善陕西小麦品种的面筋品质。本研究所构建的强筋小麦分子标记检测的多重PCR体系检测结果稳定且可靠,可用于小麦种质资源的快速评价和强筋小麦分子辅助选育。

马尾松EST-SSR PCR体系的优化

用单因素法研究马尾松EST-SSR PCR体系中各成分及退火温度对扩增结果的影响。结果显示优化后的反应体系为:2μL 10×Buffer(Mg2+Free),30 ng模板DNA,0.187 5 mmol/L-1 dNTPs,3.75 mmol·L-1 Mg2+,8 pmol引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,加水至20μL。退火温度为56℃。并用21个马尾松DNA检验这一优化体系。检测试验表明,优化后的EST-SSR PCR反应体系稳定、可靠、可重复性强。

新疆野苹果S基因特异性PCR体系优化

【目的】构建适合新疆野苹果自交不亲和基因的PCR扩增程序的优化体系。【方法】采用单因素比较试验,对影响S-RNase基因PCR反应体系的6个主要因素进行梯度扩增。【结果】在20μL的PCR总反应体系中,Mg2+的最适浓度为2.5 mmol/L,dNTP的最适浓度为0.2 mmol/L,引物的最适浓度为0.5 mmol/L,TaqDNA聚合酶的最适用量为0.75 U,模板DNA的最适用量为800 ng,最适退火温度为49℃。【结论】利用优化的扩增体系在99个新疆野苹果都获得了有效扩增,证明该体系为进行新疆野苹果S基因PCR扩增的最佳体系,具有良好的稳定性。

小麦高分子量谷蛋白14亚基基因的PCR体系及原核表达研究

小麦高分子量谷蛋白14亚基(HMW-GS1Bx14)被认为可能对面团加工品质有很大贡献的亚基.为了验证其功能,本研究欲通过PCR方法扩增14亚基基因,并使其在大肠杆菌中大量表达,为下一步用掺粉实验验证其功能奠定基础.但是由于HMW-GS1Bx14基因由2388bp个碱基组成,GC含量较高,并且在基因中包含约1.6kb的重复区,所有这些都使常规PCR难以成功扩增出HMW-GS1Bx14基因.本研究采取以下三种措施①设计一对高Tm值的特异引物;②采用二段法PCR反应程序;③改良PCR反应的缓冲体系、添加有机溶剂(DMSO,甜菜碱等)和Taq酶保护剂(BSA等);最后成功地扩增出目的片段.此外由于不同生物间对密码子使用存在很大差异,因此HMW-GS1Bx14基因很难在大肠杆菌中得到有效大量的表达.本研究选用万能菌株Rosetta(DE3)plysS作为表达用菌,从而克服了不同生物间密码子使用偏爱性的问题,成功的使HMW-GS1Bx14得到表达,为下一步研究HMW-GS1Bx14的基因功能奠定了基础.

水稻抗稻瘟病基因Pi-ta和Pi-b多重PCR体系的构建与应用（英文）

稻瘟病是我国水稻主产区的重要病害之一,其主效抗性基因Pi-ta和Pi-b在我国很多稻区表现广谱持久的稻瘟病抗性,被广泛应用于我国的水稻育种和生产。本研究选用稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b及其等位基因的功能标记,在对22份分别已知抗病基因Pita和Pi-b以及感病基因pi-ta与pi-b组成的水稻品种检测验证基础上,建立了2套稻瘟病基因多重PCR体系:体系I同时检测抗病基因Pi-ta与Pi-b,体系II同时检测感病基因pi-ta与pi-b,并利用2套体系对336份高世代育种材料进行检测,与单标记检测结果比较,表现稳定可靠,重复性好。本研究构建的抗稻瘟病基因分子标记多重PCR体系可用于水稻种质资源的快速评价和抗稻瘟病分子标记辅助育种。

苹果炭疽菌DNA改良提取法及PCR体系的优化

以苹果炭疽病胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)为试材,采用改良的SDS法、改良的CTAB法和改良的尿素法等对基因组DNA进行了提取和比较,并对ITS1-5.8S-ITS2区基因PCR扩增体系中模板的添加量以及退火温度进行了调整和优化。结果表明:采用这3种方法均能提取得到目的 DNA,但采用改良的SDS法提取的基因组DNA产率最高、质量最好;当在25μL PCR体系中添加0.75μL粗提DNA 10倍稀释液以及退火温度设定为51℃时PCR产物的质量最高。

4种PCR体系对湖北海棠DNA扩增效果的对比

用4种PCR体系(2×Taq MasterMix,Forward Primer,Reverse Primer,Template DNA,RNase-free Water;2×PCR buffer,2 mmol/L dNTPs,Forward Primer,Reverse Primer,KOD FX,Template DNA,RNase-free Water;10×Bufferfor Blend Taq,Blend Taq,Template,Forward Primer,Reverse Primer,dNTPs,RNase-free Water;10×Taq PCR Buffer,dNTP Mix,Forward Primer,Reverse Primer,MgCl2,Template DNA,Taq DNA Polymerase,RNase-free Water),分别对不同含量和质量的湖北海棠DNA进行PCR实验。结果表明,DNA稀释几倍后对4种PCR体系的影响不大,扩增的条带清晰;但不同质量DNA对4种PCR体系影响很大,低质量DNA只能在混合酶体系下才可以扩增出清晰、明亮的条带,而其他3个体系下的扩增产物均不清晰。

松江湿地沉积物细菌T-RFLP分析中PCR体系的建立与优化

细菌是微生物的重要组成部分,其对保持湿地生态系统平衡起着重要作用,在沉积物细菌T-RFLP(terminal restriction fragment length polymorphism)分析中建立与优化PCR体系对进一步研究沉积物细菌群落组成具有重要意义。此次研究以松江湿地沉积物细菌基因组DNA为模板,采用正交和单因素试验对PCR体系中各因素(模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶)进行优化,系统分析各因素对PCR扩增结果的影响,建立最佳PCR反应体系。在20μL反应体系中,DNA模板30 ng、Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.2μmol/L、Taq酶0.5 U。该优化体系确保了沉积物细菌T-RFLP分析过程中PCR产物的质量与效果。

正交优化乙醛脱氢酶2基因多态性PCR体系

目的建立通用的ALDH2基因PCR反应体系,筛选出各反应因素的最佳水平。方法采用正交设计L16(45)在4个水平5个因素(Taq酶、引物、Mg2+、dNTP和模板DNA)对ALDH2基因PCR反应体系进行实验,两次结果分别用统计软件MINITAB进行分析,利用梯度PCR确定引物最佳退火温度。结果 ALDH2基因PCR反应的最佳反应条件为:为25 L体系中包含:Mg2+(25 mM)2.5 L、dNTPs(2.5 mM)2.0 L、引物上游和引物下游各(2.5 M)3.0 L、模板DNA 3.0μL、10×PCR buffer 2.5 L、Taq酶1.5U,退火温度为60℃。结论这一通用PCR反应条件的建立为实现ALDH2基因多态性检测建立了基础。

正交设计优化CYP2C19基因多态性PCR体系

目的建立通用的CYP2C19*2和CYP2C19*3基因PCR反应体系,筛选出各反应因素的最佳水平,并确定最佳退火温度。方法采用正交设计L16(45)在4个水平5个因素(Taq酶、引物、Mg2+、dNTP和模板DNA)对CYP2C19*2和CYP2C19*3基因PCR反应体系进行实验,两次结果分别用统计软件MINITAB进行分析,利用梯度PCR确定引物最佳退火温度。结果 CYP2C19*2和CYP2C19*3基因PCR反应的最佳反应条件为25μl体系中包含:Mg2+(25 mmol/L)1.0μl、dNTPs(2.5 mmol/L)2.0μl、上游引物和下游引物(2.5μmol/L)各1.5μl、模板DNA约30 ng、10×PCR缓冲液2.5μl、Taq酶2 U、染料2.0μl,退火温度为55℃。结论建立了CYP2C19基因多态性检测方法的通用PCR反应条件。

台湾水青冈ISSR-PCR体系的优化

分析了ISSR-PCR体系中Mg2+、dNTP和BSA浓度,以及模板DNA、引物和TaqDNA聚合酶用量等6个因素对反应结果的影响,建立了适合于台湾水青冈ISSR-PCR扩增的反应体系:10μL PCR反应液中,含10 ng DNA,1.5 mmol.L-1Mg2+,0.125 mmol.L-14×dNTP,1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris-HCl,pH值9.0,50 mmol.L-1KCl,0.1%Triton X-100),0.6 UTaqDNA聚合酶,2 mg.mL-1BSA和3pmol引物。应用优化的ISSR-PCR体系从100个ISSR引物中筛选出12个稳定性好,重复性高的引物,对22株台湾水青冈个体的DNA进行扩增,结果表明优化的ISSR-PCR体系完全适合于台湾水青冈的ISSR分析。

地龙ISSR-PCR体系的建立与优化

目的:确立地龙ISSR-PCR最佳反应体系。方法:通过单因素设计试验对影响ISSR-PCR的不稳定性因素进行处理与优化,其中包括模板DNA浓度的优化,ISSR引物的筛选以及其最佳退火温度的确定,从而确定了ISSR-PCR最佳反应体系。结果:模板DNA最佳浓度为10 ng/μL,共筛选出7个地龙ISSR-PCR反应体系最佳引物及其最佳退火温度。结论:对地龙ISSR-PCR反应体系进行优化与建立,以更好地应用于地龙遗传多样性实验研究。

强筋小麦分子标记多重PCR体系的应用分析

小麦的面筋强度与其高低分子量的谷蛋白亚基种类的组合有着密切的关系。选取12个已知的亚基基因所组成的品种为对照，以基因（位点）Dx5、Bx7OE、Axnull、Glu-B3i、Glu-B3与G1u-A3d的标记，来构建多重的PCR体系。已知基因型与构建的多重PCR体系所检查对照的结果完全一致，一次的PCR可同时检测6个和强筋有关的基因（位点）Dx5、Axl／Ax2＊、Bx7OE、Glu-B3i、Glu-B3与Glu-A3d。对58个某省的小麦品种检查的结果表明，优质强筋的亚基基因（位点）Dx5、Axl／Ax2＊、Glu-B3i、Glu-B3与Glu-A3d的比例分别是9．5％、56．6％、1．7％、64.3％、33．8％，检查的58个品种均不含有Bx7OE基因（位点），携带0个、1个、2个、3个及以上的基因（位点）品种所占的百分比分别为6．4％、33．8％、48．4％和11．2％。这表明对于强筋亚基基因（位点）的品种，通过聚合优质亚基基因的育种，可以改善小麦品种的面筋强度和品质。研究的强筋小麦分子标记多重PCR体系的检测结果可靠和稳定，可用于强筋小麦品种的选育和小麦品种资源的快速选择。

叶子花SSR-PCR体系的优化

[目的]优化叶子花SSR-PCR体系。[方法]以乔木叶子花为材料,通过Touchdown PCR扩增程序和正交试验,对影响叶子花SSR-PCR体系的引物浓度、Taq DNA聚合酶用量、Mg2+浓度和d NTPs浓度进行优化。[结果]叶子花20μl SSR-PCR体系的最优条件为引物浓度0.4 mmol/L、Taq DNA聚合酶用量1.5 U、Mg2+浓度1.5 mmol/L、4种d NTPs浓度均为0.15 mmol/L,模板100 ng左右。[结论]该反应体系的扩增条带清晰、稳定、重复性好,可用于后续叶子花遗传多样性分析和种质资源鉴定等研究。

多用途树种无患子ISSR-PCR体系建立与检测

无患子(Sapindus mukorossi)是我国长江以南地区传统的重要绿化树种,其果皮富含皂苷,种仁富含油脂,为新型木本油料树种之一。为了获得基于KOD FX高保真DNA聚合酶试剂盒的无患子ISSR-PCR的最佳反应体系,该文采用正交优化设计相结合的方法,研究了引物浓度、d NTPs浓度、KOD FX酶、模板DNA浓度和Mg2+浓度对无患子ISSR-PCR反应体系的影响,并在此基础上对退火温度进一步优化,最终确立了适合无患子的ISSR-PCR反应的最佳体系和程序,即20μL PCR反应体系中,引物0.5μmol·L-1、d NTPs 0.05 mmol·L-1、KOD FX酶0.06 U·μL-1、模板DNA浓度1.0 ng·μL-1和Mg2+1.0 mmol·L-1。当以UBC841为引物时,PCR扩增程序为94℃预变性2 min,98℃变性10 s,48.6℃退火30 s,68℃延伸90 s,35个循环,68℃延伸7 min,4℃保存。这一优化的ISSR-PCR反应体系的建立,为无患子种质资源的遗传多样性、亲缘关系及遗传结构研究、种质创新与分子辅助育种等奠定了良好的基础。

许氏平鲉微卫星多重PCR体系构建及亲本对子代贡献率

为了探究许氏平鲉(Sebastes schlegelii)交配模式和父本对子代的贡献率,利用本课题组开发的13对许氏平鲉高多态性微卫星标记,基于扩增片段大小、退火温度、引物浓度等条件进行优化组合,成功构建了3个三重和2个两重PCR反应体系。同时设计10雌与10雄许氏平鮋亲鱼自由交尾实验,有4尾雌鱼顺利产仔,运用CERVUS 3.0软件对4个母本、4个家系(每个家系取94个个体)及10个候选父本进行亲权鉴定。结果表明:在双亲基因型已知的情况下,当利用5组多重PCR反应体系鉴定4个家系时,累积排除率均达到0.999 999以上,亲子鉴定准确率均达到100%,可有效鉴定许氏平鲉4个家系的亲权关系;能鉴定到父本数为3~6个,4个家系中父本数依次为6、5、4和3个,雄性亲鱼Ma2和Ma7参与到4个母本交配受精中,Ma3、Ma4、Ma5和Ma10则参与到2个母本交配受精,因此,说明"一雌多雄"和"一雄多雌"的交配模式均存在。在所有子代中,父本对子代的贡献差异很大,贡献率最高的为Ma7、Ma2和Ma6,其总和达到67.82%。其中Ma1和Ma9未发现子代,说明未参与交配或交配受精不成功,其贡献率为0。本研究可为许氏平鲉人工繁育和良种选育提供科学理论依据。

莴苣属蔬菜资源SRAP标记PCR体系的构建与优化

以莴苣为材料研究了影响SRAP标记PCR结果的因素,包括Mg2+、dNTP、引物、Taq酶的浓度以及退火温度等,建立了适用于莴苣属蔬菜SRAP分析的PCR反应体系:在20μl反应体系中,模板DNA为50ng,Mg2+浓度为2.0mmol/L,dNTP浓度为0.2mmol/L,引物浓度为0.75μmol/L,Taq酶用量为1U。适宜的扩增程序为94℃5min;94℃1min,35℃1min,72℃1min,5个循环;94℃1min,51℃1min,72℃1min,30个循环;72℃7min。对体系的验证结果表明本研究建立的莴苣SRAP体系重复性好、分辨率高、多态性丰富,在莴苣属蔬菜种质资源评价、分子标记辅助选择育种等多方面都有重要作用。

玉叶金花SSR-PCR体系的优化

[目的]优化玉叶金花SSR-PCR扩增反应体系。[方法]以红纸扇为材料,采用正交设计和单因素试验方法,从Mg^(2+)、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度以及退火温度4个方面对玉叶金花SSR-PCR体系进行优化,并采用4对SSR引物和4种玉叶金花植物样品进行验证。[结果]玉叶金花20μL的SSR-PCR反应最优体系为Mg^(2+)浓度1.50 mmol/L、d NTPs浓度0.150 mmol/L、引物浓度0.45μmol/L、TaqDNA聚合酶2.00 U、模板DNA 15 ng、退火温度53.4℃。[结论]该反应体系的扩增条带清晰、稳定、重复性好,可用于玉叶金花的SSR分子标记开发、物种分子鉴定、遗传多样性分析和谱系关系构建等相关研究。