脉冲场凝胶电泳结合PCR技术在霍乱弧菌研究中的应用

脉冲场凝胶电泳(PFGE,Pulse Field Gel Electrophoresis)结合PCR(Polymerase Chain Reaction)技术在病原微生物检测中得到越来越广泛的应用,并且逐步成为“金标准”。霍乱弧菌是人类霍乱的病原体,可存在于水产品中,其引发的食源性霍乱暴发已是全球公共卫生问题之一,通过采用脉冲场凝胶电泳结合PCR技术,将为霍乱弧菌导致的疫情防控提供更加准确可靠的手段。为了对PFGE结合PCR技术在霍乱弧菌检测领域的应用提供参考,文章对PFGE结合PCR技术在霍乱弧菌的分子鉴定、分子分型和耐药性研究等方面进行了总结,并对其在霍乱弧菌株间竞争作用的新研究方向进行展望。

琼脂糖粉的质量对PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳的影响

目的:研究琼脂糖粉的质量对聚合酶链式反应(PCR)产物琼脂糖凝胶电泳的影响。方法:PCR产物琼脂糖凝胶电泳中分别使用不同牌子的琼脂糖粉,同时跑胶图像。结果:质量差的琼脂糖粉电泳结果有明显弥散现象,而更换高质量的琼脂糖粉,未见弥散现象。结论:琼脂糖粉质量在分子生物学PCR产物琼脂糖凝胶电泳实验中扮演重要角色,使用高质量的琼脂糖粉对实验的成功至关重要。

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化PCR产物的观察

目的 :观察采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化目的 PCR产物的效果。方法 :使用不同的 31对引物 ,4 5例标本行 PCR扩增出不同的目的 DNA片段 ,将每一份 PCR产物分为 2份 ,其中 1份直接测序 ,为对照组 ;另 1份则做非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,以分离出的目的 DNA片段单链为模板行 2次 PCR,对 2次 PCR产物测序 ,此为实验组。结果 :实验组只有 4例不能被测序仪判读 (4 / 4 5 ) ,而对照组有 2 4例不能被测序仪判读 (2 4 / 4 5 ) ,两组比较 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 1 )结论 :根据单链DNA片段形成构象的不同来纯化

应用PCR与温度梯度凝胶电泳分析龈上菌斑微生物群落

目的应用PCR与温度梯度凝胶电泳(PCRTGGE)分子技术对成年健康口腔的龈上菌斑中微生物群落组成进行分析。方法8例成年个体包括4男4女,年龄19～29岁,分别采取每例个体上下颌牙周龈上菌斑样品,共18份(个体Subl间隔10天采集2次样品)。提取菌斑DNA,PCR扩增16SrDNAV3可变区,产物经TGGE后进行相似系数分析。结果同一个体的上下颌微生物群落组成相似性系数为81%～95%,而不同个体的龈上菌斑微生物群落组成相似性系数,均在60%以下。结论不同个体具有其独特的牙周微生物群落,而且在一定时期内组成稳定。

基于QIAxcel毛细管凝胶电泳分析系统的7种猪病毒检测方法的建立与初步应用

为建立同时检测7种常见猪病毒的毛细管凝胶电泳方法,本研究针对猪伪狂犬病病毒、猪乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒及非洲猪瘟病毒保守基因,设计7对特异引物,并在引物的5’端加入一段非同源性标签序列,再设计一对可识别标签序列的通用引物。经反应条件优化,建立了一种基于QIAxcel毛细管凝胶电泳分析系统的7种猪常见病毒多重PCR检测方法。该方法与O型猪口蹄疫病毒(FMDV-O)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等均无交叉反应,特异性强;所建立方法对7种病毒质粒标准品的检测下限分别为4.56×10^3拷贝/μL、6.35×10^3拷贝/μL、1.98×10^3拷贝/μL、1.32×10^4拷贝/μL、3.21×10^3拷贝/μL、4.51×10^3拷贝/μL、3.37×10^3拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示各靶条带数值间的变异系数均小于1%,该方法稳定,重复性高。该方法对65份临床样本检测结果与国标或行标单一PCR检测方法相比,二者对单一病原和混合病原检测的一致性分别为94.3%(33/35)、77.7%(14/18)。本研究建立的方法为毛细管凝胶电泳技术在动物疾病病原检测中的应用提供一定的参考。

生物技术药物中宿主DNA残留Q-PCR检测法的方法验证

自20世纪50年代,用于生产生物技术药物的细胞基质一直因其安全性而备受关注,生产用基质细胞经历了从原代细胞,二倍体细胞到传代细胞的发展历程,人们对其潜在风险的认识也在不断变化。虽然,至今没有因为生物制品中DNA残留量而引发不良反应或安全事故,但其用量随着临床治疗的需求越来越大,需要长期反复用药的生物制品也越来越多,同时,疫苗的使用者为健康人群,这些都使得药品监管部门更加重视生物技术产品的安全性，其中DNA残留量的质量控制一直是人们关注的热点。

高中PCR与凝胶电泳实验教学的探索与改进

PCR及凝胶电泳检测是新课程高中生物学选修模块的实验,两个实验全程都需要很长的时间以致无法在课堂教学时间内完成。充分利用分子生物学实验室的空间布局和相关仪器分布及使用特点,通过预实验对实验程序进行探究和改造,较好解决了这一问题。

GJB2全序列长链PCR和琼脂糖凝胶电泳方法研究

目的：探讨GJB2全序列长链PCR方法和琼脂糖凝胶电泳方法，以及影响长链PCR和电泳结果的可能因素。方法应用Primer Premier 5.0软件和Oligo 6 Demo软件针对GJB2全序列设计引物，应用DNA聚合酶KOD FX Neo试剂盒进行两步法长链PCR扩增，调整加入DNA模板量、PCR延伸时间、循环次数等影响PCR产物量，通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物长度和量，调整加样槽的宽度、加样量、电泳电压、电流、电泳时间得到清晰条带，若PCR产物存在大片段碱基插入或缺失，用限制性内切酶BamHI进行内切酶反应，初步判断插入或缺失的大致位置。结果正向引物F：5’-AGATCGGGACCTCGAAGGGGACTTG-3’；反向引物R：5’-AGGTGGGCACGGGGTTAGGTAGAAA-3’，扩增片段长5887 bp。长链PCR条件为：50μl的反应体系中加入2μl（约40 ng）的基因组DNA，预变性94℃2分钟，变性98℃10秒，68℃延伸5分钟，共32个循环。电泳条件为：加样槽5 mm宽，每槽加样0.8μl PCR产物，电泳电压50 V，电流50 mA，电泳时间140分钟。结论应用DNA聚合酶KOD FX Neo试剂盒进行两步法长链PCR，可进行GJB2全序列扩增，影响PCR的可能因素为引物、DNA模板的质和量、延伸时间、循环次数等。0.8%琼脂糖凝胶电泳可获得较好的分离效果，影响电泳可能的因素为加样槽宽度、加样量、电泳电压、电流、电泳时间等。

应用红外荧光和加尾引物法进行向日葵SSR遗传分析中的多聚PCR和多聚凝胶电泳的优化(英文)

在向日葵(Helianthus annuus L.)自交系SSR遗传分析中,为了提高SSR荧光分析效率、简化分析程序羊u降低研究费用,我们进行了多聚PCR和多聚凝胶电泳两项技术的优化研究。结果表明,优化多聚PCR和多聚凝胶电泳的影响因子(如逐步降低的退火温度的循环数、各个多聚位点引物浓度的平衡、PCR缓冲液浓度以及Taq DNA多聚酶的浓度等)可以收到更好的实验效果。基于以上的优化研究,系统地提出了一套优化的加尾引物法的策略。同时,提出了在多聚PCR和多聚凝胶电泳中常常遇到的技术难题的有效防止和解决的方法。

排除法PCR加变性梯度凝胶电泳鉴别未知基因

通过鉴别未知的cry4亚组基因来确定排除法PCR加变性梯度凝胶电泳新方法。方法 :应用排除法PCR的组基因和亚组基因引物扩增杀蚊毒素基因 ,cry4。这些引物是根据已知的cyr4基因的共有或特有DNA片段来设计的。组基因引物扩增产物被用于变性梯度凝胶电泳。平行变性梯度凝胶是由 8%的聚丙烯酰胺加上 2 0 %到 80 %的变性剂组成。结果 :已知的和未知的cry4亚组基因被组基因引物扩增的产物在变性梯度凝胶电泳被分离开。尽管它们之间仅有两个碱基对不同 (T在位置 2 2 4和G在位置 394)。应用组基因和亚组基因引物扩增 ,新发现的基因可被分类到次亚组基因水平。从 5个苏云金芽孢杆菌亚菌中发现三个未发表的cry4亚组基因。结论 :排除法PCR加变性梯度凝胶电泳是一个高度敏感、特异性和可靠性强的新方法 ,可用于鉴别各种未知的亚组基因。

关于细菌培养法和PCR检测法在淋病奈瑟菌检测中的效果

目的探讨在淋病奈瑟菌(NG)检测中应用聚合酶链反应(PCR)法、细菌培养法的效果。方法选择2015年2月至2016年5月期间在我院接受诊治的疑似淋病患者88例作为对象,取其生殖道分泌物分别应用细菌培养法、PCR检测法进行检测,观察2种方法检测结果。结果 PCR检测法、细菌培养法的检测阳性检出率分别为76.14%、44.32%,PCR检测法显著高于细菌培养法(P<0.05)。结论应用PCR检测法实施淋病奈瑟菌检测可取得更加理想的检测效果。

一种基于琼脂糖凝胶电泳法检测SARS-CoV-2的新方法

鉴于琼脂糖凝胶电泳分析方法的准确、快速、简便等特性,优化后可以做为检出COVID-19病原的新方法。在不影响结果判读的情况下,通过对扩增时间及检测样本浓度进行优化,以达到预期目的。结果表明,检测SARS-CoV-2的最优反应程序为94℃预变性3 min;94℃变性时间、56℃退火时间及72℃延伸时间均降至5 s,且进行35个循环;最后72℃孵育5 min,最优模板用量比例(初始值设为4 ng)下限调整在(1:1000)^(1:5000)范围内。阳性样本测试结果符合预期。建立了一种简便、省时,适用于检测低载量病毒样本的新方法,为临床提供诊断参考。

用PCR检测法与细菌培养法对阴道炎患者进行阴道细菌检查的效果对比

目的 :比较用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测法与细菌培养法对阴道炎患者进行阴道细菌检查的效果。方法 :选择溧阳市妇幼保健院在2015年12月至2016年12月期间收治的100例阴道炎患者作为本文的研究对象。分别采用PCR检测法与细菌培养法对这100例患者进行阴道细菌检查,然后比较其检查的结果。结果 :用PCR检测法对这100例阴道炎患者进行阴道细菌检查的阳性检出率高于用细菌培养法对其进行阴道细菌检查的阳性检出率,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 :与用细菌培养法对阴道炎患者进行阴道细菌检查相比,用PCR检测法对其进行阴道细菌检查的阳性检出率更高。

禽白血病病毒多重PCR检测法的建立及初步应用

根据GenBank中登录的禽白血病病毒A、B、J亚群的核苷酸序列设计合成了3对引物，各对引物可分别扩增出大小约为195、260、924bp的核苷酸片段：经优化建立禽白血病病毒多重PCR检测法，并进行其敏感性试验及对马立克病病毒（MDV）、

一起致泻性大肠埃希菌引起的食源性疾病暴发事件病原检测与溯源分析

目的对陕西省铜川市某工厂一起疑似食源性疾病暴发事件进行病原检测与溯源分析,以期为今后相关病原体检测工作的开展提供参考依据。方法采集该厂出现消化道症状患者的粪便样本、可疑食物剩余物样本以及后厨环境样本,利用病原体培养分离、多重PCR检测、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、药敏试验等方法对致病菌类型、毒力基因、来源、耐药表型等进行检测和分析。结果从该厂职工食堂采集可疑食物剩余物样本6份,后厨环境样本10份,医院采集患者粪便样本14份,合计30份样本中分离出肠聚集性大肠埃希菌(enteroaggregative Escherichia coli,EAEC)11株。其中14份患者粪便样本中检出9株;6份后厨环境样本中检出1株,来源为荤案板;6份可疑食物剩余物样本中检出1株,来源为凉拌肉丝。11株EAEC菌株中,有10株菌株携带毒力基因ast A、agg R,1株菌株携带毒力基因ast A;PFGE指纹图谱显示两种带型,患者粪便样本与可疑食物剩余物样本凉拌肉丝分离的10株菌株呈现同一带型,相似度为100.0%,后厨环境样本荤案板中分离的1株菌株与其他菌株带型相似度为68.6%。药敏试验结果显示病,患者粪便和可疑食物剩余物样本凉拌肉丝中分离的10株EAEC菌株对氨苄西林、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星、复方新诺明、头孢唑林表现为耐药,且超广谱β-内酰胺酶(ESBL)表型为阳性。结论本次食源性疾病暴发事件是由EAEC污染食品所导致。本次感染的致病菌株携带毒力基因ast A、agg R,ESBL表型为阳性,且对多种抗生素耐药。建议卫生监督部门今后加强食品安全管理,采取针对性的控制措施,预防和控制食源性疾病的发生,同时加强食源性致病菌的耐药监测,提升多重耐药菌暴发流行的预警能力。

肺炎支原体抗体及荧光定量PCR检测法的对比分析

目的比较研究肺炎支原体抗体及荧光定量PCR检测法在肺炎支原体感染性疾病诊断中的应用效果及价值。方法该文随机抽取2016年1月—2017年6月间该院收治的下呼吸道感染患儿500例作为研究对象,对采集到的血清标本和痰液标本分别实施细菌培养法、PCR检验法检查,比较两种检验方法的检出阳性率,并按照患儿的年龄进行分组,比较不同方法对不同年龄段、不同性别患儿中肺炎支原体的检出结果。结果抗体检测法和荧光定量PCR检验法检查肺炎支原体感染的阳性率分别为27.0%(135/500)和23.4%(117/500),抗体检测法的的阳性率略高于荧光定量PCR检验法,但比较差异无统计学(P>0.05)。具体到不同年龄段患儿的检出阳性率比较,则有<1岁患儿中,荧光定量PCR检测法检测阳性率(7.0%)更高,而≥1岁患儿中,抗体检测法检测阳性率更高,比较差异有统计学意义(P<0.05)。但不同性别患儿的应用抗体及荧光定量PCR检测法的检出阳性率比较差异无统计学意义(男性患儿的阳性率分别为26.4%、24.2%,女性患儿的分别为阳性率27.5%、22.7%)(P>0.05)。结论抗体检测法检测法更利于≥1岁患儿的诊断,荧光定量PCR检测法更利于<1岁患儿的诊断。应用抗体检测法和荧光定量PCR检测法都是检验肺炎支原体的有效方法,二者各有优缺点,联合应用可以实现优势互补,提高检测效果。

西瓜种子进行细菌性果斑病检测的研究

细菌性果斑病(Acidovorax citrulli)是一种由燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.Citrulli)引起的严重危害葫芦科作物的世界性病害,该病主要通过种子远距离传播,如果能够在种植瓜果之前就检测出种子是否带病,就能有效防止果斑病及其他更多的病菌对果农造成经济损失。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)和PCR检测法对5份西瓜种子进行细菌性果斑病检测,旨在对两种不同的检测方法进行比较并探究各自的优劣。经过实验对比两种方法发现,ELISA检测方法实验结果容易受外界影响,对操作要求比较高,且精度不如PCR检测法,但在PCR检测法中引物选择十分重要,引物选择直接关系到实验的准确性,因此对PCR检测细菌性果斑病引物选择方面的探索还要继续进行。

DNA片段的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验组织与安排

DNA扩增和DNA琼脂糖凝胶电泳实验首次推广到中学课程教学中。由于中学课时有限、班级人数多、试剂微量、试剂价格较高等诸多实际情况的制约，教学实验组织、指导和安排显得更为重要。在川布兰公司的大力支持下，2009年我校9个班近400个学生顺利完成了此项实验。每班40人共分8个小组，先做琼脂糖凝胶电泳实验（用上一个班所扩增的样品），再做DNA片段的PCR扩增实验，最后观察核酸条带。扩增前模板质粒由学生加入，在实验准备和安排上，尽量给每一个学生操作的机会。此次实验所用试剂盒为川布兰公司提供，总计费用878元。