猪源多杀性巴氏杆菌的生物学鉴定与荚膜PCR分型

从表现猪萎缩性鼻炎临床症状的猪群中分离出13株多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm),采用Pm种特异性的KMT1-KMT2引物进行PCR扩增,结果与传统的生化反应鉴定完全一致。基于对甘露醇、卫茅醇、山梨醇、海藻糖的发酵能力和产生鸟氨酸脱羧酶的特性,Q_1、Q_3、Q_6、Q_7、Q_(10)、Q_(13)和C_(48-1)鉴定为Pm多杀亚种(Pm subsp.multocida);Q_2、Q_4、Q_5、Q_8、Q_9、Q_(11)、Q_(12)鉴定为Pm败血亚种(Pm subsp.septica)。对13株Pm分离物采用A型、B型和D型引物进行PCR扩增,8株鉴定为A血清型(61.5%);5株鉴定为D血清型(38.5%);没有发现B血清型的菌株。同时对金黄色葡萄球菌抑制试验、中性吖啶黄沉淀试验与荚膜PCR分型的相关性进行了讨论。

医院感染MRSA的重复序列PCR分型研究

目的对引起医院感染的耐甲氧西林金葡菌(MRSA)进行分子流行病学调查。方法根据医院感染诊断标准,选择2008年我院MRSA医院感染患者30例和疑似医院感染患者5例,分离得到MRSA菌株36株。采用Diversilab自动化重复序列(REP)-PCR(repetitive-element sequence-based PCR)分型系统,研究MRSA菌株遗传特征和流行特点。结果 MRSA在我院的3个病房中存在6型REP-PCR指纹图。REP-Ⅰ型为优势分离株,占研究MRSA的64.86%,集中在西区急诊病房、西区呼吸病房和西区外科重症监护病房(SICU)。REP-Ⅲ型菌株全部分离自喉科术后感染患者。结论 REP-Ⅰ型菌株是我院西区MRSA感染的主要型别;MRSA在西区急诊病房的流行是此类医院感染在我院播散的重要环节;Diversilab自动化REP-PCR分型技术系统可成为医院感染病原研究的有效手段。

降解DNA的PCR分型-电洗脱回收大片断DNA法

本文分析了降解ＤＮＡ作ＰＣＲ分型易失败的原因，提出了因小片断ＤＮＡ过多，阻碍引物与膜机的复性及阻断引物延伸的新现点。将降解的ＤＮＡ电泳，切除小片断ＤＮＡ，电洗脱回收较大片断ＤＮＡ，成功地对降解ＤＮＡ进行了ＰＣＲ分型．本方法简便、快速、有效。

保定地区肾综合征出血热病人血清PCR分型及核苷酸序列测定

为明确保定肾综合征出血热 (HFRS)疫区的型别 ,采用RT PCR方法 ,检测急性期HFRS病人血清的汉坦病毒(HV)RNA ,并进行分型及部分核苷酸序列的测定 ,并与国内外HV的代表株进行比较。结果 31份急性期病人血清经RT PCR分型 ,2 4份为汉城型 (SEO型 ) ,2份为汉滩型 (HTN型 ) ,并测得SEO型C3株M基因 (位于 1985— 2 314位 ) ,HTN型LBY株M基因 (位于 1996— 2 314位 )核苷酸序列与国内外代表株的核苷酸和氨基酸序列相比较 :C3与 76 118、A9、LBY核苷酸同源性分别为 :6 8 79%、6 7 5 8%、6 8 0 3% ;氨基酸同源性分别为 :77 2 7%、77 2 7%、78 3%。C3与Seoul、R2 2相比 ,核苷酸同源性分别为 :95 15 %、93 94% ;氨基酸均为 97 2 7%。LBY与 76 118、A9、Seoul、R2 2核苷酸同源性分别为 :98 75 %、87 15 %、6 8 34 %、6 8 0 3% ;氨基酸同源性分别为 :10 0 %、96 2 3%、78 3%、78 3%。首次发现与韩国 76 118株同型(HTN型 )HV在保定的存在 。

实时荧光PCR法血清分型与全面生化反应对沙门氏菌的临床检验价值

目的:分析实时荧光PCR法血清分型与全面生化反应对沙门氏菌的临床检验价值。方法:选取医院2021年1月—2023年6月期间收治的疑似为沙门氏菌感染的患者100例,将患者粪便标本采用全面生化反应检验法,以传统微生物检验法为对照,比较两种检验方法的检出率;再分别采用传统玻片血清凝集分型法和实时荧光PCR法血清分型将鉴定出的沙门氏菌进行血清学分型,通过统计学分析方法比较两种分型方法的符合率。结果:全面生化反应检验诊断沙门氏菌的检出率(62.00%)较微生物检验法(54.00%)高,但差异无统计学意义(P>0.05);全面生化检验对沙门氏菌的诊断敏感度为95.08%、阴性预测值为92.11%,均高于微生物检验法的81.97%、76.09%,差异有统计学意义(P<0.05)。与传统玻片血清凝集分型检验相比,分子血清分型试剂盒检验对沙门氏菌血清学分型的检出符合率高(Kappa值=0.842)。全面生化反应检验、实时荧光PCR法血清分型的检验时间均短于微生物检验法、玻片血清凝集法(P<0.05)。结论:沙门氏菌临床检验中全面生化反应检验与实时荧光PCR法血清分型检验均有一定价值,若将两种方法联合应用可快速检出沙门氏菌,且能对细菌进行准确分型。

湖北地区91株嗜水气单胞菌ERIC-PCR指纹图谱分型

以采自湖北长阳、宜都、钟祥、洪湖、应城、新洲、鄂州和通山8个地区的91株嗜水气单胞菌（Aero-monashydrophila）为研究对象,应用ERICPCR技术进行分型。结果表明：大部分菌株能扩增出5-8条带,所有扩增出的条带数呈正态分布。91株嗜水气单胞菌可分为28个基因型;其中,XII和XVI基因型菌株降相对最多,占42.8%,在湖北地区嗜水气单胞菌中具有一定的代表性;通山分离的4株菌株分为IV、V和VI三种基因型,它们之间的相似性为70%左右,且ERIC指纹图谱与其他基因型之间差异显著,结合前期的研究结果,推测嗜水气单胞菌基因型与耐药性之间可能存在一定关系。

山东蒙阴县恙虫病立克次体的PCR检测和分型研究

本文报告采用恙虫病立克次体表面蛋白５６ＫＤａ基因编码区构建的群、型特异引物，ＰＣＲ检测１４份恙虫病患者血提取的ＤＮＡ模板，扩增后均见有３１７～３３２ｂｐ片段的扩增带。与血清学检测比较，ＰＣＲ具有敏感、早期诊断的意义。群引物扩增的阳性产物再经ＰＣＲ分型，结果证明山东蒙阴地区存在Ｋａｗａｓａｋｉ型Ｒｔ。

2014—2017年河南省副猪嗜血杆菌分离菌株的PCR鉴定及分型

为了解河南省猪场副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)病的血清型流行情况,本研究于2014-2017年从河南省不同县市采集813份发病猪的肺、关节液等病料样品进行流行病学调查。首先通过TSA培养基分离病原,然后采用PCR法进行分子鉴定及分型鉴定。选取3个不同血清型分离株作为代表毒株进行外膜蛋白OMP基因的扩增及序列分析。结果显示HPS总分离率为7.75%(63/813),不同年份的分离率为5.49%(13/237)~11.31%(19/168),血清4型、5型、14型、不可分型(NT)的分离率分别为38.10%(24/63)、33.33%(21/63)、7.94%(5/63)、20.63%(13/63),血清4型、5型为优势血清型,其次是14型和不可分型的菌株。三个代表毒株与国内外毒株核苷酸相似性为98.6%~99.9%,氨基酸相似性为99.0%~100.0%。遗传进化树分析表明,Henan-HPS-ZK5和Henan-HPS-KF4、Henan-HPS-LY14分别处于两个分支,其中代表血清4型和14型的毒株Henan-HPS-KF4和Henan-HPS-LY14位于同一亚支,而血清5型的毒株Henan-HPS-ZK5与前两者距离较远。OMP氨基酸序列分析显示,Henan-HPS-ZK5第57位发生了T57(Thr)→A57(Ala)的突变;血清4型、9型和14型HPS第89位、115位、233位和239位氨基酸分别为Gln(Q)、Glu(E)、Arg(R)和Gly(G),而其他血清型均为Arg(R)、Lys(K)、Gly(G)和Arg(R)(未定型菌株除外)。本研究数据在一定程度上反映了河南省HPS病发病情况及血清型流行情况,从而为河南地区HPS病的疫苗研发、控制提供了科学客观的参考依据。

牛血清清蛋白在小鼠骨肉瘤模型PCR基因分型中的应用

目的验证在PCR反应体系中加入牛血清清蛋白(BSA)可否提高小鼠骨肉瘤模型floxed Rb1基因杂合子和纯合子的检出率与准确率。方法以小鼠骨肉瘤模型子代小鼠基因组DNA为模板,进行Rb1基因的PCR基因分型。对在PCR反应体系中添加适量浓度(0.16 mg/mL)的BSA与不加BSA的PCR基因分型结果相比较。PCR引物序列涵盖Rb1基因外显子19两侧或3'端的LoxP序列。结果反应体系中添加BSA后,可成功获得PCR扩增条带:单一650 bp或247 bp(野生型)、单一700bp或295 bp(floxed Rb1基因纯合型)以及650 bp和700 bp(或247 bp和295 bp)混合条带(floxed Rb1基因杂合型),而反应体系中未加BSA的则无PCR扩增条带产生。结论 BSA可显著提高floxed Rb1基因的扩增效率,增加了该基因杂合子和纯合子的检出率并排除了假阴性结果,对于难以扩增的靶基因序列的PCR基因分型具有借鉴意义。

荧光定量分型PCR法与直接测序法检测HBV-DNA水平的应用价值比较

目的比较荧光定量分型PCR法与直接测序法检测HBV-DNA水平的应用价值。方法选取该院2012年1月—2013年12月收治的126例符合入选标准的HBV患者,分别采用荧光定量分型PCR法与直接测序法检测HBV-DNA水平,对HBV-DNA基因分型结果进行比较分析。结果 126份样本只检测出3种基因分型(B型、C型、B/C混合型),其中B型占明显优势。荧光定量分型PCR法B/C混合型检出率明显高于直接测序法(P<0.001);一致性检验表明两种检测方法的一致性较好(Kappa>0.75);TA克隆结果与荧光定量分型PCR法一致。结论荧光定量分型PCR法检测HBV-DNA水平应用价值较直接测序法高,值得临床推广应用。

130株上海地区猪链球菌血清分型调查研究

为了解上海地区历年猪链球菌流行情况、血清型分布情况,本研究对中心2003—2017年间保存的130株猪链球菌开展血清型PCR检测,并与血清凝集实验相验证。结果显示,本地区共鉴定出19种血清型,其中:优势菌株为猪链球菌2型(30.8%),其次为9型(10.8%)、7型( 9.2%),3型、8型、28型和29型均占5.4%。此外,2型、7型、9型、5型、28型、30型为门诊发病菌株的优势血清型,而19型、27型、29型和未定型菌株主要来自健康猪群。提示上海地区流行菌株存在一定的地缘性特征,9型流行率高于全国报道;健康猪群仍存在一定的2型、9型菌株携带,可能成为感染人和猪群的潜在风险因素。

上海地区种猪场健康猪群猪链球菌监测及血清分型研究

为了解上海地区种猪场猪群猪链球菌流行情况、血清型分布情况,于2020年5月,从上海8家规模化种猪场采集猪口液样品148份,开展猪链球菌监测及血清型分型研究。86份检测口液样品猪链球菌阳性,阳性率58.11%。86株猪链球菌分离株中,49株鉴定为传统血清型,血清型鉴定率56.98%;共鉴定出12种血清型,其中优势血清型为猪链球菌7型(42.86%),其次为12型(20.41%),1型和2型猪链球菌各检出1株,9型未检出。本次调查结果提示,上海地区健康猪群携带的1型、2型、7型猪链球菌可能成为感染人和猪群的风险因素。

口腔粘膜脱落细胞DNA多态性分型检测在法医学应用的初步研究

目的研究各类口腔粘膜脱落细胞的微量生物性捡材中DNA提取和检验的方法,初步论证牙刷等载体作为法医物证检材的可能性。方法分别采用Chelex-100法、有机萃取法、联合抽提法三种方法提取口腔粘膜脱落细胞载体的样本DNA,进行CTTv四个STR位点单步复合扩增和两步级联扩增两种STR-PCR方式的扩增及各位点的等位基因检测。结果实验样本中,除了1例牙刷和2例牙签未能STR位点的正确分型外,其余各无关个体口腔粘膜脱落细胞载体均可以得到与标准血痕阳性相同的STR基因型。结论根据检材的PCR相对模板DNA量,选择适宜的DNA多态性检测分型方法,各类常见的含有口腔粘膜脱落细胞检材可以进行DNA检测分型,这类检材在法医检案中具有应用价值。

降解检材STR分型Ladder-Like条带形成原因的探讨

目的探讨降解DNA短串联重复序列PCR扩增产物在PAGE中Ladder-L ike条带的形成原因。方法用一组人工合成的不同长度的D8S1179DNA单链,模拟降解检材中的断裂DNA;利用John M设计的D8S1179引物对模拟模板的DNA单链进行PCR扩增,PAGE分离。结果不同模拟模板的DNA单链的组合可以扩增出不同的Lad-der-L ike条带。结论短串联重复序列Ladder-like条带是PCR过程中降解DNA多态区互补扩增的产物。

艰难梭菌核糖体分型及腹泻发病危险因素研究

目的探讨艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)发病危险因素及进行艰难梭菌核糖体分型,为针对性防护提供依据。方法选取449例抗生素相关性腹泻患者,其中92例诊断为CDAD;采用Logistic回归分析筛选CDAD发病危险因素;厌氧菌培养艰难梭菌再行PCR核糖体分型。结果CDAD发病的危险因素是鼻饲,多种慢性病,高APACHEⅡ评分,高超敏C反应蛋白,应用第三代头孢菌素、喹诺酮类抗生素及联用抗生素;使用糖肽类、硝基咪唑类抗生素降低CDAD发病(P<0.05,P<0.01)。20株艰难梭菌分为5个亚型即GZⅠ～GZⅣ型,其中GZⅢ型8株。结论住院患者CDAD发病率较高,需针对危险因素进行防护。

HE染色涂片上精子DNA的提取与HLA—DQa基因扩增分型

本文对ＨＥ染色涂片上精子ＤＮＡ的提取、ＰＣＲ扩增分型的可行性与可靠性进行了研究。２０张ＨＥ染色涂片的实验结果表明：ＨＥ染色涂片上的精子是可以被回收并提取到ＤＮＡ进行ＨＬＡ－ＤＱａ基因的ＰＣＲ扩增分型的，其分型结果准确可靠。这说明精子的ＨＥ染色涂片也是进行ＤＮＡ分析的一种很好的检材来源。

猪链球菌9型菌株的分离鉴定

为了确诊四川省某猪场1头25日龄左右的后腿跛行并急性死亡仔猪的病因,并制定对猪群其他猪只的预防和治疗方案。本试验剖检死亡仔猪,取脾脏、肝脏、肺脏组织和血液进行细菌分离培养,革兰染色镜检,PCR分型鉴定和药敏试验。结果显示,分离培养的细菌革兰染色为阳性;分离菌株经PCR检测为猪链球菌9型;药敏试验确定该分离菌株对氨苄西林、环丙沙星、氟苯尼考、青霉素、多西环素、头孢氨苄、氧氟沙星、头孢拉定、头孢呋辛和氯霉素敏感。结果表明,该猪场仔猪为感染猪链球菌9型引起的急性死亡,通过头孢类等药物可以有效的治疗发病仔猪。

猪源产气荚膜梭菌分离鉴定、耐药性分析及益生菌对产气荚膜梭菌的抑制作用

[目的]探究产气荚膜梭菌临床分离株毒素类型、抗生素敏感性及益生菌对产气荚膜梭菌的抑菌效果,以期为产气荚膜梭菌的临床用药及防控提供理论依据和指导。[方法]通过富集培养、分离纯化、16S鉴定获得产气荚膜梭菌,毒素基因PCR扩增确定菌株类型,纸片法测定分离菌株对抗生素的敏感性,牛津杯法测定益生菌对产气荚膜梭菌的抑菌作用。[结果]获得4株产气荚膜梭菌,毒素基因PCR扩增确定4株菌分别属于B型、C型、D型3种不同类型;4株菌对头孢噻肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢呋辛、氨苄西林、羧苄西林、多西环素、米诺环素、氟苯尼考具有较高的敏感性;对阿米卡星、庆大霉素、链霉素、红霉素、麦迪霉素、阿奇霉素、林可霉素、杆菌肽、多粘菌素B、复方新诺明、甲氧苄啶完全耐药;检测了17种39株益生菌对产气荚膜梭菌的抑菌效果,综合比较发现,枯草芽孢杆菌-3抑菌效果较为突出,对4株产气荚膜梭菌的抑菌圈直径均在15 mm以上。[结论]在减抗限抗大背景下,益生菌有望成为产气荚膜梭菌防控的绿色、环保、安全的生物制剂。