木本油料植物无患子SSR特征分析及SSR-PCR反应体系构建

无患子(Sapindus saponaria L.)是集生物柴油、药用、生态等多种用途于一体的经济型木本油料。本研究利用MISA软件挖掘了无患子叶片转录组中的SSR,对搜索到的SSR进行了特征分析,构建并优化了无患子SSR-PCR反应体系。结果表明,无患子叶片转录组共有Unigene条数目为52460条,其中含有SSR的Unigene有7014条,共检索到8654个SSR。经统计,SSR丰富度从二至六核苷酸依次减少,依次有4327、2669、634、208、161个。SSR长度范围在12~250 bp之间,长度小于等于15 bp的有3619个,均为二和三核苷酸;长度大于15 bp的有5035个,以二、三核苷酸居多。所有SSR共有435种不同重复单元。SSR不同类型重复基元频次分布在4~30次之间,主要分布在4~10频次,共有7090个SSR位点,占总频次的89.65%。SSR位点靶基因GO功能注释显示,无患子叶片转录组Unigene可分为3大类别51个小组;KEGG功能注释显示5大类别中,代谢通路占比最高为65.18%。通过对无患子SSR-PCR反应体系构建与优化,无患子SSR-PCR反应体系最佳组合为:循环次数37次、退火温度60℃、引物量2.0μL、DNA模板浓度为40 ng/μL。

牛早期胚胎性别鉴定PCR反应体系的优化研究

根据牛SRY基因序列设计合成2对巢式PCR引物作为性别鉴定引物,根据牛酪蛋白基因序列设计了一对引物作为内标引物建立了牛胚胎性别鉴定的PCR反应体系。同时对常规PCR和巢式PCR在牛早期胚胎性别鉴定中的实用性进行比较。15头公牛、13头母牛的DNA样品检测结果表明:使用巢式PCR公牛可以扩增出205bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段,母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段;而使用常规PCR时公牛扩增出255bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段,母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段,其性别鉴定结果和实际完全一致。由于巢式PCR只需10个细胞就可以在紫外透射分析仪下看到扩增结果,而常规PCR则需要20～30个细胞,所以胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。试验采用巢式PCR鉴定了10个奶牛胚胎的性别,同时还对血清是否会对试验结果产生影响进行了研究。

适于核桃的RAPD-PCR反应体系的建立

采用CTAB法和改进的CTAB法,从叶片中提取核桃基因组DNA,比较其分离效果。结果表明,改进的CTAB法可有效去除细胞内多糖和多酚等杂质对模板DNA的污染。并以此为模板进行RAPD反应,对RAPD反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化试验,建立适合于核桃的RAPD-PCR反应体系,以进行该树种的分子标记研究。

利用正交设计优化水曲柳ISSR-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对水曲柳ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶,Mg2+,模板DNA,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,PCR结果用统计软件MINITAB分析:①各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中Taq酶量影响最大;②筛选出各反应因素的最佳水平,建立水曲柳ISSR-PCR反应的最佳体系(20滋l)为:Taq酶1.0U,Mg2+2.0mmol/L,模板DNA50￣200ng,dNTP0.15mmol/L,引物0.3滋mol/L。最后,对水曲柳ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火,得到最佳退火温度为58.3℃。这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术,研究水曲柳的地理变异提供一个标准化程序。

杜仲SSR-PCR反应体系建立及引物筛选

为了对杜仲种质资源的遗传多样性研究奠定理论和技术基础,采用正交试验设计和单因素分析,建立并优化了杜仲的SSR-PCR反应体系。结果表明,杜仲SSR-PCR最适反应体系为正反向引物(10μmol.L-1)各0.2μL,Taq DNA聚合酶(5 U.μL-1)0.1μL,dNTP(10 mmol.L-1)0.2μL,模板DNA(5～10 ng.μL-1)1.0μL,Mg2+(25 mmol.L-1)0.6μL,10×PCR缓冲液1.0μL,HPLC超纯水6.7μL,总体积10.0μL。同时筛选出了3对多态性有效引物,研究结果证明了微卫星引物在不同物种间的通用性受物种间亲缘关系远近的影响,并初步揭示了杜仲的遗传多样性,表明了微卫星标记在遗传多样性研究上的优越性。

党参基因组DNA提取、ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

对党参基因组DNA提取方法优化、ISSR体系形成及引物筛选三方面进行探讨,为研究党参居群遗传多样性及药材DNA鉴定奠定基础。经比较改良CTAB法、改进的高盐SDS法和试剂盒三种常用DNA提取方法,发现改良CTAB法效果最佳;利用优化设计并结合有关文献优化ISSR反应体系,最优反应体系为:50μL总反应体积中含约20ng DNA模板,1.25UTaq DNA聚合酶,2.25mmol.L-1Mg2+,200μmol.L-1dNTP,0.50μmol.L-1引物。以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出13条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。

杜仲ISSR-PCR反应体系的建立与引物筛选及其在遗传多样性研究中的应用

为了探究杜仲多居群的遗传多样性,通过开展正交试验,建立了适合杜仲的ISSR-PCR反应体系,筛选出了14条多态性较高的有效引物,分析了杜仲的遗传多样性;共扩增出108个多态性位点,多态性位点的百分率为100%,有效等位基因数ne为1.505,Nei’s期望杂合度He为0.308,Shannon多态性的信息指数I为0.472。文中初步揭示出杜仲具有较高的遗传多样性,试验结果表明了ISSRs标记技术适用于杜仲的遗传多样性研究。

石蒜属植物SCoT-PCR反应体系构建及优化

建立并优化了石蒜属Lycoris植物的目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应(SCoT-PCR)反应体系,为研究石蒜属种质资源的遗传多样性、亲缘关系及遗传改良提供新的思路。采用L25(56)正交试验和单因素试验2种方法优化石蒜属植物SCoT-PCR体系。得出石蒜属植物SCoT-PCR最佳反应体系:DNA模板2.0 mg.L-1,引物0.125μmol.L-1,三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)0.2 mmol.L-1,镁离子(Mg2+)3.0 mmol.L-1,Taq DNA聚合酶1.0×16.67nkat。对优化的反应体系进行通用性、稳定性及可靠性检测,结果均能获得丰富、稳定、清晰的DNA谱带。最后可知SCoT新型标记在石蒜属植物中应用效果良好,可为石蒜属植物以后的研究提供基础条件。

豌豆ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以豌豆(Pisum sativum L.)DNA为材料,对影响其ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA量、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶量、退火温度)进行优化,最终确定了豌豆ISSR-PCR反应的最佳体系(20μL)为:15ng模板DNA,0.15mmol.L-1dNTP,0.5μmol.L-1ISSR引物,1UTaq DNA聚合酶,引物842号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行豌豆属种质资源的遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。

油茶SSR-PCR反应体系建立与优化

油茶是我国特有的木本食用油料树种,本研究采用正交试验和单因素试验,建立并优化了油茶SSR-PCR反应体系。结果表明,油茶最适SSR-PCR反应体系为模板DNA（5~10 ng.μL-1）1.0μL,Mg2＋（25 mmol.L-1）0.7μL,dNTP（10 mmol.L-1）0.15μL,正反向引物均为（10μmol.L-1）0.2μL,Taq DNA聚合酶（5 U.μL-1）0.1μL,10×PCR缓冲液1.0μL,HPLC水6.65μL,总体积10.0μL;同时证明了微卫星位点在山茶属（Camellia L.）植物的种间通用性。研究结果将为油茶遗传多样性研究、品种鉴定、亲缘关系分析以及重要农艺性状的QTL研究提供重要的理论依据和技术支持。

仙茅属植物SRAP-PCR反应体系的优化

通过单因子和双因子实验对仙茅属植物SRAP-PCR反应体系中主要成分(Mg^(2+),dNTP、引物、模板和Taq DNA聚合酶)进行优化,并比较了琼脂糖凝胶电泳与非变性PAGE电泳的检测效果。建立了适合仙茅属植物SRAP分析的反应体系:25μL体系中内含1×PCR buffer、2.0 mmol/L Mg^(2+)、250μmol/L dNTP、0.2μmol/L引物、40ng模板、1 U Taq酶。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率较高且带型清晰,能更准确反映仙茅属植物间的差异。优化的反应体系可以用于仙茅属植物的SRAP分析。

星星草RAPD-PCR反应体系建立与优化

目的:寻找一个可用于星星草(Puccinellia tenuiflora(Griseb.)Scribn.et Merr)RAPD-PCR的最适宜的反应体系。方法:利用正交设计法对影响PCR扩增效果的一些因素诸如TaqDNA聚合酶的用量、Mg2+浓度、dNTP以及引物浓度等指标进行筛选和优化。然后,通过引物对该优化结果进行验证。结果:正交设计结果表明,最适宜的PCR反应条件:20μl PCR反应体系中包括10×buffer2μl、模板DNA20ng、dNTP1.6mmol/L、TaqDNA聚合酶0.35U、引物1.0mmol/L、Mg2+1.8mmol/L。验证结果表明,该体系扩增出的条带多且清晰。结论:该研究得出的体系是适合RAPD-PCR的最适宜的反应体系,为今后星星草遗传多样性的研究奠定了基础。

油茶SRAP-PCR反应体系的建立与引物筛选

[目的]建立油茶SRAP-PCR的反应体系,并筛选合适的引物。[方法]采用CTAB法提取油茶基因组DNA,DNA扩增时采用PCR技术,扩增结果采用电泳法和成像系统进行分离和记录。[结果]在30μl反应体系中,适宜浓度分别是Mg2+1.5 mmol/L、模板DNA90ng、引物0.21μmol/L、dNTPs 110μmol/L、TaqDNA聚合酶1.5 U;反应程序中第2次最适退火温度为49℃。随后,在36对引物组合中筛选出11对重复性好、多态性高的引物。[结论]优化的SRAP-PCR反应体系及筛选的引物为SRAP分子标记在油茶遗传育种中的应用奠定了基础。

紫花苜蓿ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过优化影响紫花苜蓿（Medicago sativa L．）ISSR—PCR的主要参数，建立适于紫花苜蓿的ISSR反应体系和扩增程序。在20μL体系中各反应物的最适含量为：15ng模板DNA，0．2mmol／LdNTP，0．4μmol／LISSR引物，0．8U Taq DNA聚合酶，2μL 10×PCR Buffer，1．5mmol／L MgCl2，2．5％去离子甲酰胺。PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，62℃（62℃～58℃）退火45s，72℃延伸1min45s，共11个循环，每个循环退火温度降1℃；94℃变性30s，52℃（52℃～48℃）退火45s，72℃延伸1min45s，共24个循环；72℃延伸5min，25℃保温。

乌拉尔甘草ISSR-PCR反应体系优化研究

甘草是中国最大宗的药材之一,具有重要的药用、生态及工业价值。利用ISSR技术对甘草种质资源的遗传多样性进行深入研究,对甘草物种生物多样性的保护及新品种培育具有重要意义。研究了影响甘草ISSR-PCR扩增效果的一些因素,实验结果表明:最适宜用于甘草ISSR+PCR分析的反应条件为:20μl反应体系中,1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液(10mmol/LTris-HCL,pH9.0,50mmol/LKCL,0.1%TritonX_100,2.0mmol/LMg2+),0.8UnitTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物,200μmol/LdNTP,10ng模板DNA。

冰草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为进一步开展冰草属植物种质资源遗传多样性研究,寻找可用于冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn.)的ISSR-PCR最适反应体系并建立与优化,具有重要的意义。通过优化影响ISSR-PCR体系的主要参数,最终确定在20μL体系中各反应物的最适含量为:40 ng模板DNA,0.2 mmol.L-1dNTP,0.5μmol.L-1ISSR引物,1 UTaq DNA聚合酶,2μL10×PCR Buffer,2.5 mmol.L-1MgCl2;引物815号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行冰草属种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。

马铃薯SSR标记多重PCR反应体系优化研究

以马铃薯品种克新18为试验材料,探讨了多重PCR反应体系主要成分、引物不同比例关系及退火温度对SSR标记扩增的影响。在不改变其他成分浓度的条件下,对PCR反应体系的4个组分(Taq酶、MgCl2、模板DNA、dNTPs)进行浓度或用量梯度试验;利用正交设计L(934)对反应体系的4对引物组合(STM0014、Pat、SSI、UGP)在3个水平上进行优化;最终确立了马铃薯SSR标记多重PCR反应优化体系,总体积为20μL;2.5μL 25 mmol.L-1 MgCl2,0.6μL 10 mmol.L-1 dNTPs,Taq酶0.8 U,模板DNA 80 ng;4 mmol.L-1的4对引物之间的用量比为2:1:2:3,退火温度为54.7℃。优化后的反应体系重复性好,扩增结果稳定可靠,能够明显区分不同的马铃薯品种。为进一步探讨马铃薯品种资源遗传多样性、构建DNA指纹图谱打下了坚实的基础。

莲SRAP-PCR反应体系的优化与建立

以中国古代莲(Nelumbo nucifera)和美洲黄莲(N.lutea)为材料,利用单因素分析法对影响莲SRAP-PCR扩增效果的模板、Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物浓度进行了探索和研究。获得了能稳定扩增莲基因组的SRAP-PCR最佳10μL反应体系:模板DNA浓度为50 ng、1μL 10×Buffer、MgCl2浓度为2 mmol/L、dNTPs浓度为0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶浓度为0.75 U、正反向引物浓度均为0.8μmol/L。为检测该优化体系的稳定性,进一步选取16对引物组合对88份花莲核心种质进行PCR扩增,获得了183条清晰的谱带,其中165条具有多态性,比率为90%,说明建立的莲SRAP反应体系是稳定可靠的。莲SRAP-PCR反应体系的优化和建立,为利用SRAP标记技术深入开展莲的遗传多样性评价、遗传连锁图构建和分子辅助育种等研究提供成熟的技术体系支撑。

光皮桦EST-SSR PCR反应体系的优化

为获得稳定的聚合酶链式反应(PCR)产物,采用正交设计L25(56)对光皮桦Betula luminifera表达序列标签-简单重复序列聚合酶链式反应(EST-SSR PCR)反应体系中的5个因素:DNA模板浓度,引物浓度,镁离子(Mg2+)浓度,三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)浓度和DNA聚合酶量进行优化,每个因素设计5个水平。优化试验结果表明:光皮桦EST-SSR最佳PCR反应体系:4.0 mg.L-1DNA模板,0.500μmol.L-1引物,1.250 mmol.L-1Mg2+,0.250mmol.L-1dNTPs,0.072 5×16.67 mkat.L-1rTaq酶。通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。对优化出的EST-SSR PCR反应体系进行稳定性检测,结果均能获得稳定、清晰可辨的DNA谱带。

樟树ISSR-PCR反应体系优化研究

以樟树基因组DNA为材料,分析了影响樟树ISSR-PCR的主要参数,确立了适用于樟树的ISSR反应体系和扩增条件。结果表明获得清晰、重复性高的樟树ISSR-PCR扩增条件为:20μL PCR反应体积中,1×PCR Buffer(10 mmol.L-1Tris.HCl,pH8.3,50 mmo.lL-1KCl),2.0 mmo.lL-1MgCl2,200μmol.L-1dNTPs,50 ng模板DNA,200 nmo.lL-1引物,0.5 UTaq DNA聚合酶。在扩增过程中,引物的适宜退火温度比其Tm值平均高3℃。这为今后利用ISSR标记技术开展樟树种间遗传多样性分析提供参考。