萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP_2基因PCR定点突变及其在大肠杆菌中的表达

根据已报道的萝卜抗真菌蛋白Rs AFP2 基因序列 ,结合基因及其表达调控中遗传密码的偏爱性 ,人工合成引物 ,利用PCR重叠延伸法 ,使编码序列区的部分核苷酸突变 ,采用嵌套PCR ,迅速克隆到目的基因片段Rs AFPm ,连接到 pGEM Teasy载体上 ,转化大肠杆菌XL1菌株 ,筛选到阳性克隆。序列分析结果表明 ,PCR产物全长 2 40bp ,有一个阅读框 ,编码 2 9个氨基酸的信号肽和 5 1个氨基酸的抗真菌蛋白 ,与突变前的Rs AFP2 基因相比 ,在编码区第 3号氨基酸Lys相差一个碱基 (TTG→TTA) ,第 5号氨基酸Gln相差一个碱基 (CAG→CAA) ,第 6号稀有密码Arg相差两个碱基 (CAG→CGA) ,但二者编码产生相同。重新合成引物 ,将切除信号肽的Rs AFP2 基因和Rs AFPm基因分别克隆到pET 2 1b(+ )质粒载体上 ,导入大肠杆菌BL2 1菌株。Tricine SDS PAGE电泳显示工程菌中存在 6KD左右的目的蛋白带 ;软件分析显示 ,突变后pETAFPm的表达产物约为突变前 pETAFPo表达产物的2倍 ;抑菌结果表明 ,pETAFPm表达产物的抑菌半径大于 pETAFP2 表达产物的抑菌半径。这些都说明改造后的Rs AFPm基因与Rs AFP2 基因相比 ,已有效的提高表达量。

PCR技术对人IL-3 cDNA进行定点突变的研究

本文利用PCR技术对人IL-3cDNA体外进行定点突变,将人IL-3cDNA第3位Met,第116位Lys密码子突变为Val密码子GTT。PCR扩增片段核苷酸序列与引物设计相应的cDNA突变体序列完全一致。结果证实此方法比经典寡聚核苷酸方法简单、迅速、成本低、效率高,也为基因的修饰,蛋白质工程研究提供了简便、稳定的方法。

定点突变和随机突变PCR构建噬菌体突变次级抗体库方法的比较

目的以突变Tomlinson I库中筛选的抗细胞黏附分子L1的胞外区单链抗体为例,对定点突变和随机突变两种构建噬菌体抗体次级库的方法进行比较。方法设计定点突变和随机PCR引物在基因水平经PCR、酶切、连接将已有噬菌粒引入突变后转染大肠杆菌构建噬菌体次级抗体库;之后使用噬菌体ELISA确定阳性单克隆比例,采用皮尔森χ2检验进行比较。结果两种方法构建的次级抗体库库容分别为1.4×106pfu/mL和2.5×106pfu/mL,两库阳性单克隆比例分别为32.5%和35.5%,二者相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论两种突变方法都有望获得高亲和力的抗体。

Gln49-磷脂酶A_2基因工程定点突变及酶活性分析

为了确认49位谷氨酰胺磷脂酶A2(glutamine 49 phospholipase A2,Gln49-PLA2)酶活性缺失与氨基酸序列的相关性,对Gln49-PLA2编码基因第49位氨基酸进行PCR定点突变,利用pET32a+质粒载体在大肠杆菌中表达Gln49-磷脂酶A2的突变体---天冬氨酸磷脂酶A2(aspartic acid 49 phospholipase A2,Asp49-PLA2-Q49D-PLA2)。将表达的包涵体蛋白变性,采用固定化金属离子亲和层析进行柱上复性、纯化获得突变体融合蛋白(fusion Q49D-PLA2-fQ49D-PLA2);突变体融合蛋白经蛋白水解酶Factor Xa酶切后,采用Hitrap SP阳离子交换层析和Superdex75凝胶层析进一步纯化,得到突变体蛋白Q49D-PLA2,得率为1.3%,比酶活为72U/mg。从而证实Gln49-PLA2酶活性缺失的关键原因是49位氨基酸为谷氨酰胺。

人CTLA4胞外区突变体在毕赤酵母中的高效表达

目的 根据毕赤酵母密码子偏好,设计并改造人CTLA4胞外区cDNA,构建毕赤酵母分泌型表达载体,以实现人CTLA4胞外区蛋白在毕赤酵母中的高效表达。方法利用PCR定点突变技术,将人CTLA4胞外区cDNA中的毕赤酵母低频使用密码子突变成高频使用密码子而不改变其氨基酸序列;经DNA序列测定证实后插入毕赤酵母高拷贝表达载体pPIC9K a分泌信号下游,SacⅠ线性化后电转GS115;G418梯度筛选转化菌;PCR鉴定目的基因整合;甲醇诱导表达,SDS-PAGE、Western blotting、肽质量指纹等鉴定表达蛋白。结果成功地对人CTLA4胞外区cDNA进行了定点突变,该突变体在毕赤酵母中能成功表达CTLA4胞外区蛋白。结论 为高效表达人CTLA4胞外区蛋白及其功能研究和临床应用奠定了基础。

突变型大肠杆菌酒石酸脱氢酶β亚基基因的克隆表达与包涵体的复性

目的利用生物工程相关技术,获得不含Cys的突变型大肠杆菌酒石酸脱氢酶β亚基,为下一步蛋白质交联奠定基础。方法利用PCR定点突变技术扩增目的基因,并将之克隆到质粒PGM-T,转化大肠杆菌DH5α。经测序证明序列无误后,将之与表达载体pTrcHisC连接,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达。目的蛋白用TALON金属亲和树脂纯化,通过分步透析逐步去除变性剂的方法复性。结果通过SDS-PAGE分析,确定目的蛋白以包涵体形式存在。复性产率可达70%。结论此次实验所得到的目的蛋白的纯度与活性均满足蛋白质交联的需要。

烟碱型乙酰胆碱受体β4亚基点突变体的构建

利用PCR介导的定点突变技术构建包含β4亚基的烟碱型乙酰胆碱受体点突变体模型,同时采用双电极电压钳技术,对激动剂ACh和拮抗剂α-CTx RegIIA对突变受体的活性进行检测。结果表明:β4亚基胞外N端序列第168位的异亮氨酸(Ile)成功突变成了丝氨酸(Ser),突变后的受体对激动剂ACh的活性降低,对拮抗剂α-CTx RegIIA的活性降低了1.4倍,半阻断剂量(IC50)为170 nmol·L^-1。

改善稀有密码子和氨基酸残基限制提高重组人ADAM15去整合素结构域蛋白表达水平

【目的】为提高重组人ADAM(A Disintegrin And Metalloproteinase)15去整合素结构域蛋白(rhADAM15)的表达水平。【方法】在详尽分析rhADAM15的cDNA和GST(谷胱甘肽-S-转移酶)-ADAM15结构的基础上,选择表达宿主菌并对表达质粒进行改造。【结果】(1)选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA的Escherichia coli.Rosetta(DE3)作为宿主菌,将质粒pGEX-ADAM15转化于其中在最佳诱导表达条件下获得298mg/L融合蛋白GST-ADAM15;(2)采用PCR体外定点突变技术将目标蛋白编码区稀有密码子GGA(Gly425)替换为GGC,使融合蛋白表达水平提高9.4%;(3)通过消除凝血酶识别序列附近的Pro-Glu-Phe残基,提高凝血酶酶切效率,使rhADAM15产量提高了35.7%;(4)在GGA替换为GGC基础上切除"Pro-Glu-Phe"残基,使rhADAM15产量提高到68mg/L,比分别切除"Pro-Glu-Phe"残基、GGA替换为GGC和野生型提高了19.2%、51.1%和61.9%。【结论】这一结果表明,在充分认识目标蛋白特性的基础上定向选择表达宿主并改造表达质粒能实现外源蛋白高水平表达。

筛选喉癌相关基因LCRG1的有效沉寂序列

目的:拟采用RNA干扰技术筛选有效的针对LCRG1基因的打靶序列。方法:首先采用PCR定点突变技术改造pSuper载体,而后利用该改造后的载体构建针对LCRG1基因的5对打靶序列的真核表达载体。将构建的重组pSuper362,398,432,789,903表达载体和pSuper空白载体分别转染He-la细胞,经抗性药物筛选获得抗性细胞克隆和池克隆;通过RT-PCR及荧光定量PCR鉴定阳性克隆,进行平板克隆集落形成试验,以检测打靶序列沉寂LCRG1基因mRNA表达水平的效果。结果:应用PCR定点突变技术改造的pSuper载体,可被BglⅡ酶切;利用RT-PCR和荧光定量PCR检测各重组载体转染细胞池克隆LCRG1mRNA的表达发现,362组,398组,432组的基因均能封闭内源性LCRG1基因表达,尤以362组为显著;鉴定362组筛选的各个抗性克隆,发现A2和A5克隆的LCRG1mRNA表达水平明显降低。平板克隆实验结果提示362组的A2,A5和池克隆的细胞增殖能力明显强于载体和空白对照组(P<0.05)。结论:成功改建了pSuper真核表达载体;362siRNA相对其他siRNA具有较好的打靶效果,这对于应用RNAi方法研究LCRG1基因的功能和其作用分子机制具有重要的指导意义。

人血管内皮抑制素基因在毕赤甲醇酵母中的表达

对发生突变的人血管内皮抑制素基因进行了PCR修正,并将其连接到pAO815载体上,然后克隆进大肠杆菌TOP10F’中,提取质粒测序,证实序列正确。再用电激法转化毕赤甲醇酵母KM71,利用RDB平板和PCR技术筛选出阳性克隆菌落后,甲醇诱导表达,SDS-PAGE电泳检测显示重组的人血管内皮抑制素蛋白在毕赤甲醇酵母KM71中获得了有效表达。

人胰岛素样生长因子Ⅰ在毕赤氏酵母中的表达研究

利用PCR定点突变技术对人胰岛素样生长因子（huIGF-I）基因进行改造,克隆到pGEMT载体测序。并构建酵母表达载体pGaAIGF-I,转化毕赤氏酵母GS115。摇瓶发酵4d后,检测表达水平占可溶性总蛋白的15％以上,且表现出较好细胞增殖活性。

雌激素受体α上调前列腺癌细胞株LNCaP中L-Plastin启动子转录活性研究

目的鉴定雌激素受体在L-Plastin启动子上的结合位点,进一步阐明雌激素受体在激素依赖型前列腺癌中的作用机制。方法利用TF SEARCH软件分析L-Plastin启动子的序列,寻找可能调控L-Plastin表达的雌激素受体结合位点,利用PCR定点突变法构建删除该转录因子结合位点的重组子,检测切除该片段序列后荧光素酶活性,并用凝胶滞后实验和超滞后实验证实雌激素受体是否结合于该位点,研究雌激素受体在激素依赖型前列腺癌中调控L-Plastin表达的作用。结果TF SEARCH软件分析表明,在L-Plastin启动子上距转录起始点-85^-70 bp处,含有雌激素受体结合位点ATTTCACTGTGACCT,删除该结合位点后L-Plastin启动子荧光素酶活性明显下降,凝胶滞后实验和超滞后实验表明雌激素受体α是结合于该位点的转录因子。结论雌激素受体α具有促进L-plastin在激素依赖型前列腺癌中表达的作用。