博尔纳病病毒荧光定量PCR试剂盒扩增缓冲液的优化

目的选择并优化博尔纳病病毒荧光定量PCR TaqMan探针法反应体系中的扩增缓冲液,使PCR反应体系对该病毒p24模板基因的扩增效率得到明显提高。方法通过常规PCR比较选择3种常用酸(盐酸、磷酸和硫酸)所滴定的缓冲液体系,在其基础上选择适合浓度的硫酸铵配制TSS buffer,在TSS buffer中分别加入四甲基氯化铵、TritonX-100、二甲亚砜和甜菜碱这4种常用的PCR添加剂,并确定各自的最佳工作浓度,选择扩增效果较好的添加剂与其他添加剂进行依次组合,寻找最佳的添加剂组合,最后用荧光定量PCR进行对比验证。结果在滴定酸上选择了效果最好的硫酸,配制TSS buffer硫酸铵的最佳终浓度为6 mmol/L。在添加剂的优化组合上,1.5 mol/L甜菜碱、0.15%Triton X-100、8 mmol/L四甲基氯化铵和TSS buffer组合成的TBTT buffer效果最佳,在其与TaKaRa PCR buffer的对比中,TBTT buffer效果明显好于后者。结论 成功研制优化出适合扩增博尔纳病病毒p24模板基因的扩增缓冲液。