荧光定量PCR探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用研究

探讨在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,观察分析应用价值。方法 本研究的时长段在2022年6月到2023年6月,统共1000例结核患者接受治疗,所有病患都拓展了抗结核药物的测验,且每一位患者的标本均予以荧光定量PCR探针熔解曲线法检测,药物敏感性测定结果为黄金基准,考察判辨荧光定量PCR探针熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的诊断效能。结果 针对1000例的标本中,经过液体药敏试验检测显示对利福平药物耐药例数250例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者;对异烟肼医药有耐药性的液体药敏试验500例,应用溶解曲线检测耐药性包含了470例;经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数170例,予以熔解曲线法显示耐药140例。经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数300例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者。熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的灵敏度分别为84.00%、84.00%、47.06%、66.67%;特异度分别为96.00%、90.00%、84.34%、94.29%;准确度分别为93.00%、97.00%、91.00%、86.00%。结论 在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,可得到较高的应用价值,灵敏度、特异度、准确度较高,可筛查结核病患者对利福平、异烟肼、乙胺丁醇等药物的耐药性,为临床治疗疾病提供可靠的依据。

荧光PCR探针熔解曲线技术检测痰标本中结核分枝杆菌异烟肼耐药性的研究

目的评价荧光PCR探针熔解曲线(fluorescence polymerase chain reaction probe melting curve,Melt Pro)技术检测痰标本结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)异烟肼耐药性的应用价值。方法收集2021年5月至2022年5月在北京市疾病预防控制中心结核病门诊Gene Xpert MTB/RIF检测为MTB的(简称MTB阳性)患者痰标本,对每份标本同时进行涂片镜检、分枝杆菌分离培养、Melt Pro技术和线性探针技术(Geno Type MTBDRplus,简称Hain试验)异烟肼耐药检测。分析Melt Pro技术检测痰标本MTB异烟肼的耐药性,痰标本荷菌量对检测结果的影响;以培养阳性菌株异烟肼比例法药敏结果为参考标准,评价Melt Pro技术耐药检测效能。结果收集MTB阳性的合格痰标本157例,经分枝杆菌分离培养获得阳性菌株130株。Melt Pro技术痰标本MTB异烟肼耐药性检测成功率为84.1%(132/157)。不同痰涂片结果等级间,Melt Pro技术检测异烟肼耐药成功的比例差异存在有统计学意义(H=24.169,P=0.000),随痰涂片结果等级的升高,检测成功率由“阴性”标本的64.8%(35/54)升高到“3+”“4+”标本的100%(17/17,6/6);该比例也随Gene Xpert MTB/RIF检测MTB等级的升高而升高,由“极低”标本的54.8%(17/31),到“高”标本的96.4%(27/28),各等级间差异有统计学意义(H=27.763,P=0.000)。Melt Pro技术、Hain试验和药敏试验的异烟肼耐药检出率分别为22.0%(29/132),15.3%(19/124),和14.6%(19/130),三者差异无统计学意义(χ^(2)=2.997,P=0.223)。以培养阳性菌株比例法药敏试验结果为参考标准,Melt Pro技术检测异烟肼耐药的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为:84.6%(11/13)、91.2%(93/102)、55%(11/20)、97.9%(93/95),Kappa值为0.614;Hain试验检测异烟肼耐药的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为:55.6%(10/18)、92.3%(84/91)、58.8%(10/17)、91.3%(84/92),Kappa值为0.490。结论Melt Pro技术可直接检测痰标本MTB耐药性,快速准确筛查患者耐药情况,缩短耐药筛查时间。

实时荧光PCR探针法和DNA测序法应用于CYP2C9和VKORC1基因检测的对比研究

目的:比较实时荧光PCR探针法和DNA测序法检测细胞色素氧化酶P450(CYP2C9)和维生素K环氧化物还原酶复合体1(VKORC1)基因多态性的一致性,建立适用于临床推广的华法林基因多态性检测的方法。方法:本研究随机收集清远市人民医院20例就诊患者的全血标本,应用实时荧光PCR探针法和DNA测序法检测其CYP2C9和VKORC1基因的多态性,结果运用Excel软件统计并进行比较分析。结果:两种方法对CYP2C9和VKORC1基因多态性的检测结果一致,且实时荧光PCR探针法比DNA测序法更简易、经济、快捷。结论:与DNA测序法相比,应用实时荧光PCR探针法检测CYP2C9和VKORC1基因的突变具有较高的临床应用价值,比较适用于临床检测。

PCR探针熔解曲线法在对肺结核患者进行结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用效果

目的 :探讨PCR探针熔解曲线法在对肺结核患者进行结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用效果。方法 :将2018年1月至2018年3月期间在青海省第四人民医院门诊或住院部接受治疗的20例肺结核患者作为研究对象。使用PCR探针熔解曲线法对这20例患者体内结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素的耐药性进行耐药基因检测。然后,以药敏试验的结果为金标准,观察这些患者体内结核分枝杆菌的耐药基因检测结果与利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素耐药表型的一致性。结果 :这20例患者体内结核分枝杆菌的耐药基因检测结果与利福平、异烟肼耐药表型的一致性较高,其体内结核分枝杆菌的耐药基因检测结果与乙胺丁醇、链霉素耐药表型的一致性较低。结论 :PCR探针熔解曲线法在对肺结核患者进行结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用效果显著,可迅速地筛查出患者体内结核分枝杆菌对利福平等常用一线抗结核药的耐药情况。

多重不对称PCR探针熔解曲线法在一管中检测多个肥胖易感基因方法的建立

目的针对中国人群4个常见的肥胖易感基因位点(FTO基因rs1421085位点、APOA5基因rs662799位点、FABP2基因rs1799883位点、ADRB3基因rs4994位点),建立一种方便、精准、低成本的检测方法。方法结合前期研究中发现的与中国人群肥胖密切相关的4个基因位点,设计引物对、荧光探针以及对应等位基因的靶序列,通过熔解曲线法,验证荧光探针与对应等位基因的靶序列的工作效果,确认不同基因型的熔解温度。采用PCR-Sanger测序法为金标准,对收集的人唾液样本进行检测,选取12个基因型的样本,开发多重不对称PCR荧光探针熔解曲线法进行检测。随后,使用多重不对称PCR探针熔解曲线法与PCR-Sanger测序法分别对200例志愿者的唾液样本进行基因分型检测,比较两种方法的结果与优缺点。结果多重不对称PCR探针熔解曲线法可以在一管中同时对4个常见的肥胖易感基因位点进行检测,准确度与PCR-Sanger测序法相同,且与PCR-Sanger测序法需有扩增、电泳、纯化、s测序的复杂步骤相比,可在一管中一次完成检测,操作更为便捷,且成本更加节省。结论本研究建立了一种针对4个常见肥胖易感基因位点的方便、精准、低成本的基因分型方法,为人群肥胖易感基因的批量筛查提供了一种有效的检测手段。

猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)早期痕量检测方法,该研究以PEDV的M基因为靶基因,设计了特异性引物和锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)-TaqMan探针,经过条件优化,建立了基于LNA-TaqMan探针的PEDV荧光定量PCR方法,并与常规TaqMan探针法进行了比对。结果显示,所建立的PEDV的LNA-Taq-Man探针荧光定量PCR方法最低检测限为3.2拷贝/微升,较常规TaqMan探针法提高了10倍;与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒等多种病原不存在交叉反应,特异性良好;批内和批间重复性结果的变异系数均小于1%,重复性较好。应用该方法对103份临床样品进行检测,结果显示,共检出PEDV阳性样品47份,阳性率45.63%,与常规TaqMan探针法检测结果的阳性符合率为90.38%。本研究建立的基于LNA-TaqMan探针的荧光定量PCR方法为PEDV的精准检测和流行病学调查提供了一种新的技术选择。

PCR制备地高辛标记的探针检测禽流感病毒核酸

用聚合酶链反应 (PCR)技术 ,制备了广东禽流感无致病力分离株 A/goose/China/2 4/96 (H7N3 )核蛋白基因片段(NPc)的地高辛标记的 c DNA探针。建立并优化了检测禽流感病毒核酸的探针杂交法 ,探针杂交法能鉴别出非免疫鸡胚和SPF鸡胚尿囊液中的病毒 ,攻毒后第 3天的 SPF和非免疫鸡泄殖腔拭子中 AIV的最大检出率为 1/10 ,对临床样品中的 AIV的最大检出率为 1/7,而直接 HA和 HI法及 AGP试验检不出临床样品的 AIV。该探针具有较好的特异性和敏感性 ,为从分子水平探讨 AIV的发病机理、临床早期快速诊断提供了新的研究手段。

PCR荧光探针法检测4种生殖道病原体的结果分析

目的探讨PCR荧光探针法、培养法、胶体金法和酶联法检测淋病奈瑟菌、解脲脲原体、沙眼衣原体及单纯性疱疹病毒-2型的阳性检出率,评价不同检测方法检测4种生殖道病原体的结果差异和应用价值。方法收集北京佑安医院性病门诊就诊者生殖道分泌物1738例、血液标本227例,采用PCR荧光探针法进行解脲脲原体、淋球菌、沙眼衣原体、单纯性疱疹病毒-2型检测,并同时采用培养法检测解脲脲原体、淋球菌;胶体金法检测沙眼衣原体;ELISA法检测单纯性疱疹病毒-2抗体,对PCR荧光探针法及其他3种方法检测结果进行分析。结果478例PCR荧光探针法和培养法同时检测解脲脲原体中,PCR荧光探针法检测阳性率[38.7%(185/478)]略低于培养法检测阳性率[39.96%(191/478)],差异无统计学意义(P>0.05);654例PCR荧光探针法和胶体金法同时检测沙眼衣原体中,PCR荧光探针法检测阳性率[7.34%(48/654)]高于胶体金法检测阳性率[3.21%(21/654)],差异有统计学意义(P<0.001);379例PCR荧光探针法和培养法同时检测淋球菌中,PCR荧光探针法检测阳性率[9.50%(36/379)]略高于培养法检测阳性率[7.65%(29/379)],差异无统计学意义(P>0.05);227例PCR荧光探针法和ELISA法同时检测单纯性疱疹病毒-2型中,PCR荧光探针法检测阳性率[3.52%(8/227)]低于ELISA法检测阳性率[10.57%(24/227)],差异有统计学意义(P<0.05)。结论PCR荧光探针法可提高衣原体、淋球菌检出率,可用于解脲脲原体特异性检测和单纯性疱疹病毒-2型现症感染检测。

结核病与BCG疫苗接种个体TaqMan探针荧光定量PCR诊断方法的建立及初步应用

为快速鉴别诊断结核病(TB),本研究以GenBank登录的致病性结核分枝杆菌复合群、人型结核杆菌和牛分枝杆菌特有基因为对象,设计并合成引物及探针,建立TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。实验结果表明,该方法对标准质控菌株反应呈阳性,对卡介苗(BCG)及其他微生物样品反应呈阴性;对结核分枝杆菌或牛分枝杆菌标准菌株的检测灵敏度可达单个菌细胞水平。对45份结核菌素PPD皮肤试验结果为阳性的临床样本进行TaqMan探针荧光定量PCR检测,36份为阳性;而对PPD检测为阴性的50份临床样本进行检测时,7份为阳性。本研究结果表明,所建立的方法可用于TB的鉴别诊断,可对由BCG接种或环境中分枝杆菌引起的PPD检测假阳性样本进行鉴别,对TB的快速检测和早期诊断具有重要意义。

PCR/DNA探针检测系统用于间日疟原虫检出及基因型检测的研究

根据间日疟原虫环子孢子表面蛋白（ＣＳＰ）基因序列研制了ＰＣＲ／ＤＮＡ探针检测系统。试验证明该检测方法对间日疟原虫特异，检出原虫密度为０．２个／μｌ，病人阳性检出率为９６．２％。试验中对不同ＰＣＲ操作过程及试验样本不同处理方法的检测结果进行了比较。在样本的原虫基因型检测分析中，基因优势型ＰＶ２１０阳性率为８８．５％，基因变异型ＰＶ２４７阳性率为１１．５％，混合型阳性率为３．８％。

PCR荧光探针法在Y染色体微缺失检测中的应用

目的比较无精子症因子(azoospermia factor,AZF)PCR荧光探针法与多重聚合酶链反应结合琼脂糖凝胶电泳检测法的结果吻合度。方法收集2016年6月至2017年6月来我院就诊的208例男性不育患者外周血。根据WHO 2010年第5版精液分析操作指南将208例患者分为正常精子症组、无精子症组和少精子症组。用PCR荧光探针法对208例男性不育患者检测Y染色体无精子症因子,然后采用多重聚合酶链反应结合琼脂糖凝胶电泳检测208例不育患者Y染色体无精子症因子。结果在208例不育男性患者中,正常精子症组有100例,无精子症组47例,少精子症组61例。PCR荧光探针法检测Y染色体无精子症因子,少精子症组1例AZFc区(SY254/SY255)缺失,无精子症组1例AZFabc区缺失,正常精子症组未发现基因缺失类型。多重聚合酶链反应结合琼脂糖凝胶电泳检测法结果与PCR荧光探针法检测结果一致。结论 2种方法检测的患者无精子症因子基因的结果吻合度一致。与多重聚合酶链反应结合琼脂糖凝胶电泳检测法相比,PCR荧光探针法一次上样可以做48个样本,节省了时间与成本,结果自动保存,可以作为Y染色体微缺失检测的推荐方法。

布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据布鲁菌BCSP31基因序列设计布鲁菌通用检测引物和探针,建立了布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法。以构建的含BCSP31基因的质粒标准品10倍递进稀释为模板检测其敏感性,结果显示,本方法能检测约10个拷贝的阳性质粒,且标准曲线的线性关系良好。用本方法检测5株不同种的布鲁菌以及猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等4株对照菌。结果显示,5株不同种的布鲁菌均出现典型的"S"型扩增曲线,4株对照菌40个循环内均无CT值出现。用本方法和B4/B5-PCR方法对来自布鲁菌病流行地区3个不同牛场的40份血样、奶样和血清样进行平行检测。结果显示,本方法和B4/B5-PCR方法的结果符合率为80.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的27份样品经本方法检测均为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的13份样本,经本方法检测,其中8份呈阳性,5份为阴性。本方法的敏感性明显高于B4/B5-PCR方法。试验表明,所建立的Cycling探针荧光定量PCR方法具有敏感、特异、稳定等特点,可用于布鲁菌感染的快速检测。

荧光探针定量PCR技术

PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增,实现目的基因的检测.荧光探针定量PCR(FQ-PCR)是一种新的基因定量检测技术,国外文献多用"实时定量PCR(real time quantitative PCR)"或"TaqMan PCR(以美国PE公司商标命名)".该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针,巧妙地把核酸扩增(PCR)、杂交及光谱技术结合在一起,从而实现了对目的基因的准确定量检测,正发展成为临床实验诊断的常规技术.

犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种特异、高通量检测犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,本研究选取高度保守且具有型特异性的CDV H基因和CPVVP2基因序列,设计CDV和CPV特异性引物对及TaqMan MGB探针;经反应条件优化,建立了检测CDV和CPV的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,该方法检测CDV、CPV的标准曲线线性相关系数(R^2)分别为0.997和0.993,最低检出限均为10拷贝/μL,具有较高的灵敏性;对犬副流感病毒等4种病原对照和阴性对照均未出现扩增,特异性良好;CDV、CPV标准品批间试验结果显示,该方法具有很好的重复性;对48份临床疑似CDV或CPV感染样品检测结果显示,14份为CDV阳性,19份为CPV阳性,4份为CDV/CPV双阳性,与CDV H基因、CPVVP2基因测序结果符合率为100%。本研究建立的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、高通量和可准确定量等优点,可用于临床CDV/CPV病毒感染各个时期的快速鉴别检测。

液体培养法与荧光探针PCR检测阴道分泌物中解脲脲原体的应用价值

目的评价荧光探针聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法与液体培养基培养法检测阴道分泌物中解脲脲原体(ureaplasma urealyticum,UU)的临床应用价值。方法选取江苏省东台市人民医院检验科2019年1月—2021年12月收治的138例疑似泌尿生殖道感染者,分别采用荧光探针PCR法和液体培养法检测阴道分泌物,以Amsel临床诊断标准为金标准,比较两种方法的解脲脲原体检出率,并比较联合方式和单一方式检测疾病的诊断效能,对比两种方式报告获取时间。结果液体培养基培养法对UU的检出率为76.09%,高于荧光探针PCR法的57.25%,差异有统计学意义(P=0.031);两种方式联合对疾病的诊断灵敏度、特异度和准确率高于单一检测方式,差异有统计学意义(P<0.05)。荧光探针PCR法报告获取时间明显短于液体培养基培养法,差异有统计学意义(P<0.05)。结论建议临床联合使用两种方法同时检测,更有利于解脲脲原体感染的诊断和治疗。

荧光探针定量PCR及其临床应用

荧光探针定量PCR (FQ—PCR)由PCR与荧光素标记的探针杂交技术相结合,可用来检测临床标本中各种病原微生物的RNA/DNA。具有快速、简便、敏感、特异之优点。因其在单一试管内进行PCR扩增,可避免普通PCR由于污染所造成的假阳性,并可定量检测各种病原微生物的RNA/DNA含量。

PCR荧光探针法诊断急性白血病化疗后结核1例并文献复习

急性白血病化疗后发热并肺部阴影多见,若行经验性抗菌治疗效果不好,需行进一步鉴别诊断,明确病原体,做到目标治疗。我科收治1例白血病病人化疗后反复发热,经PCR荧光探针法确诊为肺部结核,经抗结核治疗获得较好疗效。本文报告其临床资料,并结合相关文献介绍白血病合并肺部结核的特点以及PCR荧光探针法诊断的优势。

牛传染性鼻气管炎gB基因TaqMan探针及SYBR Green 1荧光定量PCR方法的建立与比较

为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)荧光定量PCR检测方法,本研究利用IBRV g B基因序列设计引物及相应探针,分别建立Taq Man探针与SYBR Green 1荧光定量PCR方法,并对两种方法的敏感性等综合比较。结果显示,SYBR Green 1荧光定量PCR方法的相关系数(R2)为0.998,扩增效率(E)为95.7%;Taq Man探针荧光定量PCR方法的R2为0.999,E为108.3%;两种方法的敏感性均为0.2 TCID50,变异系数均小于3%。综合结果显示,两种检测方法无显著差异。最后,本研究成功建立了检测IBRV的荧光定量PCR,将为IBRV的临床检测提供方法。

荧光探针PCR与膜芯片技术在女性生殖道HPV分型的对比研究

目的探讨荧光探针PCR与膜芯片分型技术在检测女性生殖道人乳头状瘤病毒中的应用情况，并进行临床应用评价。方法门诊230例妇女同时利用荧光探针PCR与膜芯片分型技术检测其宫颈脱落细胞HPV—DNA，其中70例进行阴道镜宫颈组织病理活检。荧光探针PCR定性检测14种高危型HPV病毒（包括HPVl6，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68和66）．同时对其中的HPVl6和HPVl8型进行分型检测。膜芯片分型技术检测23种HPV型，包括上述14种HPV，另外还有HPV53，73，82和83高危型和5种低危型HPV病毒（HPV6，11，42，43和81）。结果荧光探针PCR定性检测HPV的阳性率为11．30％（26／230），膜芯片分型技术检测HPV的总阳性率为19．57％（45／230），高于荧光探针PCR定性（P〈0．05）。二者检测14种高危型HPV病毒总的符合率为94．35％。在70例病理活检中荧光探针PCR定性和膜芯片分型技术检测为HPV-DNA阳性的妇女中，宫颈上皮内瘤变2级以上，分别为26．92％（7／26）及22．22％（10／45），分剐高于其HPV—DNA阴性对照组的4．55％（2／44）及4．00％（1／25）（P〈0．05）。结论荧光探针PCR与膜芯片分型技术比较，在检测常见14种高危型HPV方面结果具有较好的一致性，更适合大规模健康体检中的应用。然而两种方法又有其不同的优势，应结合具体情况进行应用。

扎伊尔型、苏丹型埃博拉病毒TaqMan探针实时定量PCR核酸检测方法的建立

目的建立针对扎伊尔型(ZEBOV)及苏丹型埃博拉病毒(SEBOV)特异、灵敏和快速的Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法。方法选用世界卫生组织(WHO)参比实验室所使用的引物和探针序列,建立针对扎伊尔型及苏丹型埃博拉病毒的NP基因序列保守区的Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法,验证检测方法的灵敏性、特异性和稳定性,并与常规PCR检测方法进行比较。结果所建立的实时定量PCR方法可用于ZEBOV及SEBOV的特异性检测,较传统PCR方法反应快捷、灵敏,分别可达:ZEBOV 34拷贝/反应、SEBOV 24拷贝/反应;具有良好的特异性、稳定性和可重复性。结论建立了ZEBOV及SEBOV Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法,该方法可有望用于埃博拉病毒(EBOV)的实验室、临床及现场核酸检测。