弓形虫PCR检测试剂盒的组装和初步应用

研制弓形虫PCR检测试剂盒,观察临床应用效果。根据GenBank公布的弓形虫MIC3基因序列,设计合成1对特异性引物,对PCR反应条件进行优化,分别对试剂盒的特异性、敏感性、重复性、稳定性和保存期进行研究,之后进行临床试验。该诊断试剂盒能扩增出弓形虫特异性基因MIC3片段,与猪球虫、贾第虫、猪旋毛虫和隐孢子虫无交叉反应;该检测方法最低能够检测到10个弓形虫速殖子的DNA,不同批次的试剂盒对同一样品检测和同一批次对不同样品检测,有较高的重复性和稳定性,且常温下可保存1年以上,临床应用效果显著。该检测试剂盒对弓形虫病早期诊断、流行病学调查和卫生检疫提供了检测手段。

3种致泻大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒的研制与效用评价

本研究为了研制一种多重PCR检测试剂盒,用于对肠道致病性大肠埃希氏菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)、产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shigatoxin-producing E. coli,STEC)和肠道出血性大肠埃希氏菌(Enterohemorrhagic E. coli,EHEC)3种DEC(Diarrheagenic E. coli,DEC)的快速检测。优化所涉及的多重PCR检测体系和构建相应的检测试剂盒,其中的主要检测试剂采用冻干工艺,评价该试剂盒的检测特异性、灵敏度、重复性以及保质期。结果表明,本研究成功建立了针对于3种DEC的检测体系EP和检测体系ST;3种DEC标准菌株和分离菌株均出现明显的目标基因条带,而其他种类DEC标准菌株和分离菌株均未出现目标基因条带;该试剂盒检测管EP和检测管ST的检出限分别可达到1.5×10^3 cfu/mL和2.1×10^3cfu/mL,且二者检测重复率均为100%;该试剂盒可在4℃条件下保存12个月,也可在42℃环境运输120h,期间其检测效力不受影响。本研究研制的试剂盒性能好,检测结果稳定、可靠,适用于食品中3种DEC的快速检测。

套式PCR检测试剂盒用于普查疟疾带虫率的评价(英文)

【目的】评价套式PCR检测试剂盒在疟疾现场监测中的效果。【方法】对疟疾从高度流行区转入低度流行区的非洲科摩罗Moheli岛居民,采集其指血2 098人份,同时制作厚血片和抗凝血样,用自制的套式PCR检测试剂盒检测所采集血样中的疟原虫,并与镜检法进行比较。为了避免假阳性,试验中设置了阴性对照组和阳性对照组。【结果】2 098份血样中,套式PCR技术阳性数140人,阳性率为6.67%;镜检阳性数63人,阳性率为3.00%。【结论】套式PCR检测试剂盒检测疟疾感染具高度敏感性,在疟疾控制转入清除阶段,采用此法普查可发现低密度疟原虫携带者,对快速清除传染源将有重要价值。

小鹅瘟和雏鹅新型病毒性肠炎二联PCR检测试剂盒组装和初步应用

本试验旨在研制小鹅瘟和雏鹅新型病毒性肠炎二联PCR检测试剂盒,观察临床应用效果。根据小鹅瘟和鹅病毒性肠炎基因序列,设计合成一对特异性引物,对PCR反应条件进行优化,并分别对试剂盒的特异性、敏感性、重复性和保存期进行研究,之后进行临床扩大试验。该二联PCR诊断试剂盒能扩增出预期的小鹅瘟375bp核酸片段和鹅病毒性肠炎223bp核酸片段,与鸭瘟病毒、鹅副黏病毒无交叉反应;最低能检测到小鹅瘟病毒104 ELD50/mL,雏鹅新型病毒性肠炎病毒2.5×10-1ELD50;不同批次的试剂盒对同一样品检测结果一致;常温下至少可保存5个月;临床应用效果显著。该二联PCR检测试剂盒能够对小鹅瘟和雏鹅病毒性肠炎早期诊断、流行病学调查和卫生检疫提供了检测手段。

PCR检测试剂诊断对虾白点病毒

对虾白点病 (whitespotdisease ,WSSV)目前急需准确、快速的病毒诊断技术 .PCR诊断方法是目前已知的最佳选择 .但PCR技术在使用上存在着某些问题 ,例如专一性、灵敏度、假阳性、假阴性及定量等 ,是选择PCR做为病毒诊断试剂时 ,必须慎重考虑的问题 .市面上已有商品化的虾白点病毒诊断试剂供养殖者选用 .IQ2 0 0 0系统采用已经过证实的白点病毒核酸序列作为PCR的反映标的 ,具专一性强、灵敏度高、可同时进行定性及定量检测、包含了内控制组及阳性标准品、可有效地排除假阴性及假阳性的问题等特点 ,无论在学术研究及实际养殖上都可证明其功效 .以IQ2 0 0 0为基础所发展出来的虾白点病毒安全指标 ,可提供养殖户作为虾白点病毒防治的参考依据 .

基于非洲猪瘟病毒标准物质的荧光PCR检测试剂盒初步评价

为探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)标准物质作为试剂盒评价体系的可行性,比较了市场上5种主流品牌ASFV荧光PCR检测试剂盒的检测性能。使用ASFV P72基因核酸标准物质作为模板,根据5种试剂盒说明书分别进行相应的荧光定量PCR检测,结合扩增曲线、Ct值,分析不同试剂盒的敏感性、可重复性以及所需反应时间。结果显示:5种试剂盒的阴性、阳性对照均成立,最低检测限均为5.9×10^(-1)拷贝/μL;4个厂家的试剂盒线性关系R2>0.98,其中最优的R^(2)=0.994,离散度最小;各试剂盒的实际反应耗时与理论反应耗时均有一定差异(0.20~0.96 h)。结果表明,各生产厂家使用P72基因作为靶基因研制的ASFV荧光PCR检测试剂盒都可以使用ASFV标准物质作为评价体系,来评判试剂盒的检测性能。本试验为各实验室不同样品检测的ASFV荧光PCR检测试剂盒选择提供了一种可用的评价方法。

猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测试剂盒原材料研究

通过对比3家公司生产的Taq酶、PCR反应缓冲液和UDG酶,对已建立的猪圆环病毒2型(PCV2)荧光定量PCR检测试剂盒中阳性参考品、最低检测限参考品、精密性参考品和阴性参考品进行制备。结果表明:Takara宝生物工程(上海)有限公司生产的Taq酶、PCR反应缓冲液和上海博彩生物科技有限公司生产的UDG酶的试剂组合扩增效率最高,荧光增长值的平均值达182464,各组合间Ct值无显著性差异。本试验可为相关荧光定量PCR检测试剂盒的药证申报提供参考。

羊痘病毒PCR检测方法的建立和试剂盒的研制

根据GenBank上已发表的羊痘病毒(CPV)的全基因序列,设计并合成了一对能特异性扩增羊痘病毒的引物,扩增产物大小约为445bp。通过对PCR方法的优化,建立了检测羊痘病毒的PCR方法,并研制出检测试剂盒。同时对试剂盒的敏感性,特异性和稳定性进行了研究。实验结果表明,该试剂盒具有良好的敏感性和特异性,稳定性在-20℃至少可以保存一年。

食品中克罗诺杆菌属双重PCR检测试剂盒的评价

【背景】在食品安全领域,克罗诺杆菌属于需要重点监测的致病菌,当前随着分子检测相关技术的不断发展,研制有关食品中克罗诺杆菌简便、高效的检测产品至关重要。【目的】研制克罗诺杆菌检测的双重PCR检测试剂盒并评价其用于食品中克罗诺杆菌检测的实效性。【方法】优化双重PCR反应体系,反应试剂采用冻干工艺,确立了试剂盒组成,并评价其特异性、灵敏度、重复性、保质期等性能指标。【结果】克罗诺杆菌标准菌株和分离菌株均在目标位置出现两条明显条带,非克罗诺杆菌标准菌株和分离菌株均检测为阴性,纯基因组DNA检测灵敏度为2.3×10-1 ng/μL,纯培养菌检验限为3.2×104CFU/mL;对65份食品样品进行克罗诺杆菌检测,该试剂盒检测结果与标准方法检测结果一致性较高;批内、批间检测重复率均为100%,可在42°C环境放置120 h且其检测效力不受影响,4°C保质期可长达12个月。【结论】该试剂盒性能好,检测结果稳定、可靠,适用于食品中克罗诺杆菌的快速检测。

干燥型荧光PCR试剂盒检测食源性致病菌研究

目的研究干燥型荧光PCR试剂盒检测副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌3种食源性致病菌的灵敏度、特异性和检测人工污染样品情况。方法目标菌和非目标菌接种至血平板, 36℃培养过夜,目标菌比浊至0.5 McF(麦氏单位), 10倍连续稀释后提取DNA,进行灵敏度研究;非目标菌直接提取DNA后检测,进行特异性研究;用高、中、低3个浓度目标菌液人工污染食品样品,按国标方法培养后用干燥型荧光PCR试剂盒检测。结果副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌的最低检测浓度分别为140、380和7900 CFU/mL。3种目标菌人工污染食品样品的最低检测浓度分别为1.2 CFU/25 g、5.1CFU/25 g、10 CFU/25 g。每种试剂盒仅对目标菌株的检测结果呈阳性,非目标菌株均呈阴性。结论新型干燥型荧光PCR检测试剂盒具有较好的灵敏度和良好的特异性,适用于食品中副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌的检测。

肿瘤个体化诊断PCR类检测试剂体系探讨

随着肿瘤靶向治疗的不断发展,以荧光定量PCR技术为代表的恶性肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂在临床中的地位越来越重要。由于肿瘤细胞具有异质性,临床对PCR原理检测试剂的准确度、特异度、精密度、检测限等提出较高要求,相关生产企业应对该类检测试剂有严格的质量控制体系。尽管国家药品监督管理局已经出台相应指南,对标本处理、实验设计、体系设置和质量控制等提出了明确的要求,但仍有很多实验设计的细节内容尚需明确。该文针对肿瘤个体化PCR扩增检测试剂在研发和临床使用中的规范要求,依次对肿瘤核酸提取和纯化的方法学、PCR体系设置、质控体系建立等进行了归纳和探讨,有望指导相关生产企业对该类试剂的产品设计、研发和注册申报。

利用PCR技术检测537份新疆结核病人痰标本中的结核分枝杆菌

目的 提高聚合酶链反应在检测人结核分枝杆菌中的特异性和敏感性。方法 在聚合酶链反应中对 4种DNA片段即结核杆菌特异插入序列IS6 110 ,IS10 81,和 16SrRNA ,6 5kDa摸板进行了比较 ;为获取较多的细菌DNA ,临床痰标本处理采用了国际标准化方法主要包括用一定量的N -乙酰 -L半胱胺酸和氢氧化钠处理痰标本 ;改进了RCR混和液的成份即添加了甘油 ,dUTP -尿嘧啶糖基化酶。结果 选择IS6 110作为结核杆菌特异性摸板用于检测细菌DNA ,制备出了 6批人结核杆菌PCR检测试剂盒 ,在对来自新疆结核病研究所的 5 37份痰标本的检测中发现 ,该试剂盒检测的特异性为 6 5 .97% ,敏感性为 93 .5 3 %。结论改良TB -PCR试剂盒显示有较高的敏感性 ,特异性还有待于进一步完善 ,该试剂盒在临床诊断中有一定的价值。

6种非洲猪瘟荧光PCR试剂盒对比试验

对5个厂家的6种非洲猪瘟荧光PCR试剂盒检测的敏感性和一致性进行综合比较,选取已知阳性的核酸样品作为待测样品进行梯度稀释,每组设置三个平行对照,使用A1、A2、B、C、D、E6种试剂盒,按照各厂家试剂盒说明书对所有样品进行非洲猪瘟荧光PCR检测及结果判定,并从检出ct值的样品数量、检出核酸最低拷贝浓度、检出ct值的平均值和检出ct值的离散度四个维度来综合评估对6种试剂盒的敏感性和一致性。结果显示:检测灵敏度方面,由高至低的排名为试剂盒D>试剂盒C>试剂盒A2>试剂盒E>试剂盒B>试剂盒A1;检测一致性方面,试剂盒D>试剂盒C>试剂盒A2>试剂盒E>试剂盒B=试剂盒A1。综合6种试剂盒的敏感性和一致性来看,试剂盒D的灵敏度和一致性最好,试剂盒C稍低于试剂盒D,但差距很小,几乎在同一水平,试剂盒A2灵敏度和一致性次之,其余三种试剂盒E>试剂盒B>试剂盒A1。

新发现的红拟石首鱼溃疡病病原海藻施万氏菌的分离和分子鉴定

首次从患溃疡病的养殖红拟石首鱼 (Scinenopsocellata)病灶和肠、肝、肾等处分离到多株细菌 ,发现其中两株经注射和创伤感染后 ,能引起体表溃疡 ,肠道积水等症状 ,与自然发病表现类似。经过生理生化鉴定为弧菌科 (Vibrionacea)施万氏菌属 (Shewanella) ,进一步用1 6SrDNA扩增测序鉴定该菌为海藻施万氏菌 (Shewanellaalgae) ,其主要特征为 :革兰氏阴性 ,TCBS生长 ,产硫化氢 ,嗜盐 ,不利用葡萄糖产酸或产气 ,也不发酵其他糖类产酸 ;蛋白酶 ,硝酸盐还原酶 ,氧化酶阳性 ;具有较强的溶血活性。利用作者研制出的PCR检测试剂盒 ,对海藻施万氏菌进行了快速的分子鉴定。