用YADE法克隆球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的启动子及启动子序列分析

扩增与已知序列相连的未知序列是一项常用的分子生物学技术。与其它方法相比,目前在棉花上应用的YADE法具有效率高,成本低和假阳性低等特点。因此,作者尝试将该法引入到昆虫病原真菌的分子生物学研究,并取得了成功,建立了适合于球孢白僵菌和金龟子绿僵菌的YADE的技术体系。类枯草杆菌蛋白酶在昆虫病原真菌穿透寄主体壁时起重要作用,作者在已克隆的球孢白僵菌类蛋白酶基因CDEP-1的基础上,利用YADE法,克隆类球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的启动子CDEPP。序列分析发现:CDEPP中没有明显的TATA和CAAT框,含有8个可能的碳调控因子的结合位点5'>(g/c)YggRg<3'和2个氮调控因子的结合位点——相隔很近的GATA。这与CDEP-1的表达受碳/氮抑制的结果一致。本文的结果将会为研究CDEP-1的表达规律奠定基础。

亚心型扁藻叶绿体psbA基因的克隆及序列分析

psbA基因是叶绿体基因组中一个重要的光调控基因,编码光和系统Ⅱ反应中心的D1蛋白。根据叶绿体基因组序列高度保守的特性,利用莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)psbA基因的保守序列(基因登录号:HQ667991.1)设计引物,采用PCR步移的方法从亚心型扁藻(Platymonas subcordiformis)基因组DNA中克隆到psbA基因全长(基因登录号:KF528742)。序列分析表明,亚心型扁藻psbA基因全长1939 bp,编码区长度为1062 bp,推导编码353个氨基酸,包括4个赖氨酸残基。有效密码子数显示psbA基因具有明显的密码子偏好性,并且偏好使用以A/T结尾的密码子。相对同义密码子使用度表明25个密码子在编码使用时具有偏好性,其中20个密码子以A/T碱基结尾,占到80%。其终止密码子使用了TAG。

芥菜型油菜A9染色体黄籽基因区域BAC重叠群的构建

A9染色体是芸薹属植物A基因组最长的染色体(序列约37 Mb),具有控制种子大小、种皮颜色、硫苷合成、油脂合成等重要性状的基因。利用芥菜型油菜A9染色体黄籽性状共分离标记A9-88和A9-32对已经构建的ZBjH BAC文库进行PCR步移筛选,共筛选出BAC 752个,测序395个,得到BAC末端序列674条,利用BAC末端序列设计引物533对,此外利用白菜已经公布的序列设计SSR引物38对、STS引物15对,构建了芥菜型油菜黄籽基因区域估算长约2.2 Mb的BAC重叠群。

鸭肠炎病毒UL6基因的分子特征

为了研究鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）UL6的特征，以DEV Clone-03株基因组DNA为模板，用靶基因步移PCR方法扩增得到UL6基因区域2534bp的DNA片段。结果发现，DEVC lone-03 UL6基因由2373个核苷酸组成，编码一条790个氨基酸残基组成的多肽。与14株已报道的具有全UL6同源基因序列的疱疹病毒参考株进行比较，DEV Clone-03株与α疱疹病毒的核苷酸和氨基酸同源性较之与8疱疹病毒和γ疱疹病毒要高。氨基酸序列比较显示，DEV Clone-03 UL6基因具有α疱疹病毒UL6同源基因5个保守区域。UL6基因推导的氨基酸系统发育进化树分析发现，DEV Clone-03与α疱疹病毒属一个群，在α疱疹病毒中与马立克氏病病毒（Marek’s disease herpesvirus，MDV）更接近。同时，序列分析发现，在201～222和425～441等氨基酸位，α疱疹病毒参考毒株均有不同程度的缺失，而DEV Clone-03表现出独有的完整性。

芥菜型油菜A09染色体BAC重叠群的构建及分析

利用定位在芥菜型油菜A09染色体上的分子标记对芥菜型油菜(Brassica juncea)ZBjuH BAC文库进行PCR步移筛选。共筛选出725个BAC,测定了315个BAC的末端序列,获得564条BAC末端序列,BLAST分析表明这些末端序列对应白菜(Brassica rapa)基因组序列支架45、支架81、支架40,支架134、支架145和支架59的同源区域,构建了芥菜型油菜A09染色体大约6.3 Mb的BAC重叠群,为芥菜型油菜A09染色体物理图谱构建奠定了基础。

Pseudomonas putida GM6多聚磷酸盐激酶(ppk)基因的克隆及表达

以一株高效聚磷菌Pseudomonas putidaGM6为研究材料。为获得其多聚磷酸盐激酶(polyphos-phate kinase,ppk)基因,并验证该基因在磷酸盐转运系统中的作用,根据已报道的ppk基因保守区域设计引物,从其总DNA中成功扩增到ppk基因的部分片段(约528 bp)。随后采用快速染色体步移方法(Self-formed adap-tor PCR,SEFA-PCR)技术扩增片段的上下游基因序列,将三个序列拼接,用OMIGA软件分析其ORFs,推测ppk基因全长为2 220 bp(GenBank accession number DQ133537)。构建的多聚磷酸盐激酶表达菌株E.coliBL21(DE3)/pET29a-ppk经IPTG诱导后3 h时,明显出现分子量约为81 kDa的表达产物。且表达菌株在12 h时的磷去除率高达80%(对照菌株的磷去除率仅为18%),远高于已报道的40%的去除率。这表明ppk基因在E.coli中的过量表达,导致了E.coli菌体中poly-P的大量聚集,从而大大去除了培养基中的磷酸盐。

外源基因插入位点旁侧序列的研究方法及进展

外源基因插入位点的研究,是转基因植株分子检测的一项重要内容。本文综述了近些年用于旁侧序列测定的染色体步移技术及其发展,介绍了基于基因组文库和PCR的染色体步移技术。同时总结了基因组文库步移、反向PCR、锅饼PCR、T-linker PCR和TAIL-PCR的原理及其特点,以期在实验方法的选择上提供参考意见。