成人流感样病例13种病原体检测情况及多重PCR毛细电泳片段分析法检测的临床应用

目的探究成人流感样病例中13种病原体分布情况及多重聚合酶链反应(PCR)毛细电泳片段分析法在病原体检测中的应用价值。方法收集2019年12月至2020年2月北方地区189份流感样病例咽拭子标本,采用多重RT-PCR与毛细电泳片段分析法联用技术得到病原体的检测结果。检测病原体包括甲型流感病毒(InfA)、人腺病毒(HADV)、博卡病毒(Boca)、人鼻病毒(HRV)、甲型流感病毒H1N1(2009)(InfA-H1N1)、季节性流感病毒(InfA-H3N2)、副流感病毒(HPIV)、人偏肺病毒(HMPV)、乙型流感病毒(InfB)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)、冠状病毒(HCOV)、人呼吸道合胞病毒(RSV)13种病原体。结果189份流感样病例咽拭子标本中有180份(95.24%)检测出病原体,9份(4.76%)未检测出病原体。180份病原体阳性标本单一病原体150份(83.33%),多种病原体30份(16.67%);145份(80.56%)检测出流感病原体,35份(19.44%)检测出非流感病原体。3种最常见的单一病原体是InfA-H3N2(94份,49.74%),MP(26份,13.76%),InfA(16份,8.47%);3种最常见的多种病原体是InfA-H3N2合并MP感染(15份,7.93%),InfA合并MP感染(7份,3.70%),MP合并HRV感染(3份,1.59%)。结论2019年12月至2020年2月冬季我国北方地区的成人流感病毒主要以InfA-H3N2为主;非流感病毒也可引起流感样病例,以MP感染较多见;部分流感样病例可见混合感染。多重PCR毛细电泳片段分析法有助于全面了解成人流感样病例中病原体分布情况。

毛细管电泳片段分析法、荧光定量PCR法在ALRTI患儿咽拭子标本病原体诊断中的应用对比观察

目的毛细管电泳片段分析法、荧光定量PCR法在急性下呼吸道感染患儿咽拭子标本病原体诊断中的应用。方法急性呼吸道感染患儿65例(65份咽拭子标本),分别采用毛细管电泳片段分析法、荧光定量PCR法检测患儿咽拭子病原体,比较两种方法病原体检出率,并分析两种检测方法与金标准(Sanger测序法)检测结果的一致性。结果毛细管电泳片段分析法病原体检出率为52.3%(呼吸道合胞病毒21份、副流感病毒4份、衣原体病毒2份、腺病毒2份、鼻病毒2份、偏肺病毒3份、博卡病毒1份,其中1份为合胞病毒与鼻病毒混合感染),荧光定量PCR法病原体检出率为45.0%(呼吸道合胞病毒20份、副流感病毒3份、衣原体病毒2份、腺病毒1份、鼻病毒1份),两种方法病原体检出率比较,P>0.05。毛细管电泳片段分析法与Sanger测序法检测结果阳性一致率为100.0%,阴性一致率为100.0%,准确率为100.0%;荧光定量PCR法与Sanger测序法检测结果阳性一致率为86.2%,阴性一致率为93.5%,准确率为90.0%。结论毛细管电泳片段分析法与荧光定量PCR方法病原体检出率无差异,但毛细管电泳片段分析法能检测出病原菌混合感染,且与Sanger测序法检测结果有高度一致性,有更高的临床应用价值。

PCR-毛细电泳片段分析法检测毛细支气管炎病原的临床价值探讨

目的探讨PCR-毛细电泳片段分析法(PCR-CEFA)检测毛细支气管炎病原的临床应用价值。方法选取2018年1至12月温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院儿科收治的因毛细支气管炎住院的≤24个月且喘息次数≤2次的患儿932例,采集患儿鼻咽分泌物,采用PCR-CEFA检测呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(RV)、流感病毒(Flu)、副流感病毒(HPIV)、腺病毒(ADV)等8种病毒核酸;直接免疫荧光法(DFA)检测RSV、HPIV、Flu、ADV抗原;并收集患儿性别、年龄、既往喘息史、湿疹史、哮喘家族史、家族过敏性疾病史、总IgE、血嗜酸性粒细胞计数(B-Eos)等资料。比较两种方法、不同年龄组患儿病毒检出率及RSV组与RV组患儿流行病学资料及实验室检查结果。结果PCR-CEFA病毒检出率为88.2%,高于DFA的33.6%,差异有统计学意义(P<0.01)。PCR-CEFA对RSV、HPIV、Flu、ADV的检出率均高于DFA,差异均有统计学意义(均P<0.01)。以DFA为参照,PCR-CEFA检测RSV、HPIV、Flu、ADV的特异度均达80%以上。≤12月龄患儿RSV检出率高于>12~24月龄患儿,RV、ADV、HBoV检出率均低于>12~24月龄患儿,差异均有统计学意义(均P<0.05)。RV组患儿年龄、B-Eos升高比例均明显高于RSV组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论与DFA比较,PCR-CEFA病毒检出率更高,病毒检测种类更多,具有良好的特异度,有利于早期明确毛细支气管炎病原。

参照多重PCR片段分析法进行实时荧光PCR法对ABCB1三等位基因测定结果读取方法的确定

目的为解决实时荧光PCR法对三等位基因测定结果无法正常读取的问题,通过参照多重PCR片段分析法,确定实时荧光PCR法读取方法,实现临床对ABCB1三等位基因准确、简便且价格低廉的检测。方法收集西安市精神卫生中心2020年3月-2021年3月DNA样本2794例,抽取5%作为实验样本,分别进行实时荧光PCR法和多重PCR片段分析法测定。根据PCR曲线Ct值的比较以及多重PCR片段分析法碱基峰位强度的比较,对比分析两种方法的判读结果,对其中报告结果不相同的样本进行数据核查并确定PCR读取方法。结果共抽取139例样本,其中存在120例等位基因及19例三等位基因,实时荧光PCR法和多重PCR片段分析法对等位基因的检测结果完全一致。根据多重PCR片段分析结果,对19例三等位基因制定了实时荧光PCR法的读取方法:扩增曲线图中,当∣∣Ct._(G)-Ct._(T)∣-∣Ct._(G)-Ct._(A)∣∣<3,分别读取两组碱基Ct值小的碱基,将其组合形成判读结果;当∣∣Ct._(G)-Ct._(T)∣-∣Ct._(G)-Ct._(A)∣∣≥3,读取两组碱基Ct值最小的碱基,其纯合型即为判读结果。根据读取方法,修正实时荧光PCR法的测定结果为:1例G/G,1例A/A,4例T/G,5例T/A,8例T/T,与多重PCR片段分析法结果一致。结论通过多重PCR片段分析法制定实时荧光PCR法对ABCB1三等位基因的读取方法,两者判读结果一致性良好。

用于PCR分析的水稻DNA简易提取法——CS法

以PCR技术为基础的DNA分子标记是迄今在作物转基因检测、标记辅助选择、农作物品种纯度鉴定等方面最具应用前景的分子标记技术，而快速、简易、低成本的DNA提取方法是其中的关键因素之一。本实验以水稻黄化苗为材料，用NaOH溶液抽提DNA，对其用于PCR技术的DNA标记的效果进行了分析。结果发现，用O．5M．NaOH对黄化苗进行直接处理，并用等量1M Tris—HCI进行稀释、中和，离心所得的上清液即可直接用于各种：PCR扩增和随后的DNA标记鉴别，包括转基因PCR片段检测、微卫星标记多态性分析(琼脂糖电泳法或毛细管电泳法)，这样提取的DNA可以在短期内保存，在PCR分析中其效果与用常规CTAB法提取的DNA相当。

PCR-RFLP法检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T突变

目的 建立一种简便、实用的检测亚甲基四氢叶酸还原酶 (MTHFR)等位基因 C677T点突变的方法 ,并初步观察部分健康老人和老年血管性痴呆 (VD)患者中 MTHFR等位基因 C677T点突变情况。方法 PCR特异性扩增 MTHFR基因序列 ,扩增产物用限制性内切酶 Hinf 酶切 ,经聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)分离、溴化乙锭染色后 ,观察酶切位点的限制性片段长度多态性 (RFLP)图谱。共检测标本 1 67例 ,其中健康老人(≥ 65岁 ) 1 38例、老年 VD 2 9例 ,并计算了各基因型频率和等位基因频率。结果 健康老人组和老年 VD患者组均检测到 C等位基因野生型 (CC)、杂合子 (CT)和 T等位基因纯合子 (TT)基因型 ,各组 MTHFR基因的 C677T点突变中 T突变位点的频率分别为 43.8%、51 .7%。结论 该方法简便、实用 ,适于一般实验室应用及流行病学调查。

芯片毛细管电泳快速定量检测DNA

脱氧核糖核酸（DNA）是生物的基本遗传物质，快速、灵敏、定量检测DNA是生命科学研究领域中极其重要的内容。近年来，作为一种高效能的分析方法芯片毛细管电泳（MCE）用于基因研究成为热点，芯片毛细管电泳在DNA研究方面涉及到DNA的序列分析，用DNA标准品法分析PCR产物的纯度，DNA片段多态性分析用于法庭的个体鉴定，临床诊断等。

简便快速的PCR产物回收方法

目的 分析比较几种PCR产物回收方法的回收效果。方法 针对PCRDNA的回收效果及回收特点 ,采用内皮素 (Endothelin)基因PCR反应产物 ,分别利用本室建立的二种新方法———速冻 -快速离心法、凝胶浸泡法和传统方法———玻璃珠试剂盒回收法对PCR产物DNA进行回收 ,用琼脂糖凝胶电泳鉴定 3种方法回收PCR产物的效果。结果 发现两种新方法回收DNA带的亮度强 ,与传统方法相比 ,差异无显著性 (P >0 .1 0 )。结论 说明速冻 -快速离心法与凝胶浸泡法不仅具有玻璃珠试剂盒回收PCR产物的效果 ,而且经济、方便、可靠 。

血标本存放时间与PCR法检测乙肝DNA结果的关系

笔者自1992年开始应用PCR技术于临床分析工作,经过近2年的实践,深感血液标本的有效时间对实验成败有着较重要的影响。现就血标本的存放时间对该试验的影响观察报告如下。1 材料和方法1.1 样本;本院住院乙肝患者初次PCR检查阳性者的血清。1.2 试剂:第四军医大学西京医院临床分子生物学研究中心配制PCR乙型肝炎诊断试剂盒,该引物是根据乙肝病毒C基因序列设计,扩增片段长度为424bp。

丽水市十三项呼吸道病原体感染情况及特点分析

目的了解丽水市呼吸道病原体感染情况及流行病学特征,为呼吸道传染病诊疗与防控提供科学依据。方法回顾性分析2020年3月至2021年12月丽水市人民医院收治的4035例呼吸道感染患者13项呼吸道病原体PCR毛细电泳核酸检测结果,并分析病原体感染分布特征。结果呼吸道病原体感染患者阳性检出率为32.24%(1301/4035),检出率前5位分别是HRV(16.60%)、HRSV(7.09%)、HPIV(2.87%)、HMPV(2.21%)、HADV(1.96%)。混合感染阳性占比为7.61%(99/1301),Boca病毒(76.0%)与Ch(46.15%)易与其它病原体形成混合感染。不同性别呼吸道病原体感染率差异无统计学意义(P>0.05)。虽然不同季节呼吸道病原体整体感染率差异无统计学意义(P>0.05),但HRV好发于春秋两季,而HPIV在春秋两季感染率较低,春季HRSV感染率较低,HADV在夏秋两季感染率较低,HMPV在冬季较为流行。未成年人呼吸道病原体感染率较高,HRSV、HRV、HPIV、HADV和Boca主要发生于未成年人组,InfB和HMPV在未成年和青年人群感染率都较高。结论未成年人群是呼吸道病原体易感人群,应加强未成年人呼吸道传染病防控。

微小按蚊A、C的PCR和同工酶鉴别比较研究

目的比较PCR和同工酶两种鉴别微小按蚊A、C亲缘种的方法。方法将现场采集后经形态初步鉴定为微小按蚊的样本,经PCR产物酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)与乌头按蚊和杰普尔按蚊区分,等位基因特异扩增法(PCR-ASA)进一步鉴别微小按蚊A和C。再将用此方法鉴别后的微小按蚊羽化24h内单只虫体样本,采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳,加以辨别区分。结果经测序验证,PCR方法可以简单明确地将微小按蚊A、C加以鉴别。几种用于鉴别的同工酶中,只有酯酶(EST)同工酶对微小按蚊A、C具鉴别意义。结论对于微小按蚊A、C的鉴别,PCR方法明显优于同工酶方法。

甲醛溶液保存的中华哲水蚤基因组DNA提取和PCR扩增

提取了保存于5%甲醛溶液中的单只中华哲水蚤基因组DNA.经凝胶电泳后虽无清晰条带,但PCR扩增后可得线粒体DNA细胞色素氧化酶I亚基基因(mtCOI)片段.测序分析,该片段长度为710bp,与GenBank中的序列(索引号AF332769)比对后确定为中华哲水蚤mtCOI序列的一部分.利用本实验方法所提取的基因组DNA可适用于系统发生、种群遗传结构等领域的分子水平研究,为保存在甲醛溶液中的小型海洋浮游动物的基因信息利用提供实用技术.

厦门市1846例呼吸道病原检测分析

目的通过对呼吸道病原多重核酸检测结果进行分析,了解2019年3—8月厦门市呼吸道病原的流行规律,为临床疾病诊治提供依据。方法利用PCR毛细管电泳片段分析法,对1846份呼吸道感染患者咽拭子进行12种常见呼吸道病原的检测,计算检出各种呼吸道病原的阳性率和混合感染情况,比较不同月份、年龄患者常见呼吸道病原检出阳性率的差异性。结果在1846份样本中,呼吸道常见12种病原总阳性率为65.2%,其中肺炎支原体和腺病毒检出阳性率最高,分别为24.4%和24.1%。混合感染389例,占总阳性检出病例的32.3%。按月份分析,3—8月份总阳性数呈上升趋势,但不同病原有不同的流行规律。按年龄组分析,不同的病原流行规律不同。结论肺炎支原体和腺病毒为厦门市呼吸道感染的主要病原体。呼吸道病原的检出存在时间和年龄的差异。呼吸道病原体多重核酸检测在临床的应用,有助于呼吸道感染患者的早期诊治。

人MAGE-3基因片段的克隆与测序

目的克隆表达人MAGE-3基因片段(210～623位碱基),以便研究其对MAGE-3阳性恶性肿瘤的生物学作用。方法为选择靶基因,采用分子生物学软件分析MAGE-3基因抗原表位;并设计MAGE-3靶区域引物。从人肺癌组织标本中提取mRNA,用RT-PCR法从中扩增出MAGE-3片段,对其进行XhoⅠⅡ酶切鉴定;将扩增片段克隆于pGEM-TEasy载体中,转化JM109,进行阳性筛选后,运用pGEM-TEasy质粒的T7/SP6作为引物对重组子鉴定,并进行DNA测序。结果抗原表位分析表明MAGE-3基因片段(210～623位碱基)为抗原决定簇丰富区段。RNA体外扩增得到的片段为414bp,并经XhoⅠⅡ酶切鉴定得到证实;pGEM-TEasy-MAGE-3经筛选鉴定正确,DNA测序结果与Genebank比较完全相同,表明靶基因成功插入pGEM-TEasy。结论该片段可用于真核及原核表达。

3株致病性鸡大肠杆菌P型菌毛结构基因的克隆、序列测定及同源性分析

用鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的基因组DNA做为模板,PCR分别扩增出了0.55kb的P型菌毛结构基因(papA)。将扩增得到的3个papA基因片段分别克隆进pGEM-T○R载体中,转化至受体菌JM109中,用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选法,得到含阳性重组子的菌株,提取质粒后用BamH和Sal双酶切进行鉴定。所得阳性重组子进行DNA序列测定,测序结果经DNAStar核酸分析软件包分析比较,结果表明,所构建的克隆质粒中均含有相应完整papA基因,其开放式阅读框架大小为549bp,编码182个氨基酸。此3株菌的P型菌毛结构基因的同源性为98.9%～100%,其中O1株和O78株的P型菌毛基因的ORF序列100%相同,O2株有2个碱基与前两者不同。

载脂蛋白E基因多态性与慢性乙型肝炎病毒感染分析

目的分析载脂蛋白E(ApoE)基因多态性及其对慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染性免疫的影响。方法白细胞介素(IL)-2检测采用放射免疫法,聚合酶链反应(PCR)法扩增ApoE基因片段,用荧光偏振的方法检测ApoE基因型。结果轻度组ApoEε4高于正常值范围,并与中度、重度组相比差异有统计学意义(P均<0.05),与ApoEε3、ApoEε2组相比ApoEε4组有较高的IL-2和总胆固醇水平。结论高水平的ApoEε4基因可通过调节IL-2和血脂水平减轻HBV感染后引起的肝细胞炎症反应及肝损伤。

BRCA1基因全长mRNA序列分析技术

目的:建立BRCA1基因全长mRNA序列测定方法。方法:根据文献和GenBank(U14680)报道的BRCA1基本序列设计6对特异性引物,建立6个特异性逆转录PCR(RT-PCR)技术,分段且扩增BRCA1全长mRNA,然后采用毛细管电泳进行cDNA测序,方法建立后用于3名健康女性样本。结果:6个特异性RT-PCR反应扩增片段相互覆盖,使序列分析结果包括全长BRCA1mRNA,共5000多bp。3名经PCR技术检测确定携带正常BRCA1基因的样本的mRNA分析结果显示,其BRCA1mRNA序列均与过往报道的正常mRNA序列完全一致。结论:所建立的RT-PCR特异性结合BRCA1基因,能用于其mRNA全长序列分析。

HPV核酸检测及基因分型试剂盒的性能验证及评价

目的对某公司生产的人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测及基因分型检测试剂盒(PCR毛细电泳片段分析法)进行性能验证。方法用PCR-反向点杂交技术对待应用的检测HPV亚型试剂盒的准确性、重复性、最低检出限、交叉特异性及抗干扰能力等性能指标进行性能验证及评价。结果该试剂盒采用的PCR毛细电泳片段分析法检测的30例HPV样本中有6例结果不一致,经一代测序验证,与PCR毛细电泳片段分析法检测的结果一致,符合率为100%;重复性和最低检出限均符合要求;解脲支原体、沙眼衣原体、淋球菌和白色念珠菌与该HPV核酸检测及分型试剂盒不存在交叉反应;抗干扰物质对其检测结果无明显影响;与PCR-反向点杂交技术对比,该HPV试剂盒检测对HPV总体阳性率无显著性差异,而对HPV单一感染及多重感染的检出率有差异。结论HPV核酸检测及基因分型试剂盒(PCR毛细电泳片段分析法)性能参数评估合格,可以满足临床样本的检测需求。

土壤微生物分子生态学研究中总DNA的提取

建立了一种土壤DNA提取方法。根据DNA产量和纯度2个评价指标,从3种手提土壤DNA方法中优选出方法B为手提DNA方法(Labmethod),它包括样品预处理,细胞裂解,粗DNA纯化,其中细胞裂解组合了玻璃珠击打,SDS裂解,溶菌酶裂解。进一步应用PCR-限制性片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)技术及PCR-温度梯度凝胶电泳(Temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)技术,结合DNA产量、纯度、片段大小以及所反映的微生物群落结构特性等指标评价了手提方法(Labmethod)得到的总DNA质量,并将这些结果与2种应用较广的商业试剂盒(MoBioUltraCleanSoilDNAKit和Bio101FastDNASPINKit(ForSoil))所得DNA的各种指标进行了比较。结果表明,手提方法(Labmethod)的粗DNA产量低于Bio101Kit的,但高于MoBioKit的。这些方法所得DNA的长度都在21kb左右,Labmethod提取的DNA没有严重被剪切现象,而2种试剂盒提取的DNA都有不同程度的剪切。手提方法得到的DNA经纯化后,应用细菌及真菌特异引物进行PCR扩增,均能获得目的片段,表明该方法能从土壤中同时有效提取细菌和真菌总基因组DNA。并且,手提方法所得DNA的细菌16SrDNA和真菌18SrDNA的PCR-RFLP图谱与两种商业试剂盒的图谱基本相似,但3种方法提取的DNA在细菌16SrDNAV3区和真菌28SrDNA片段的PCR-TGGE图谱上都存在一定差异,主要表现在一些弱势条带的有无或强弱上。这说明手提方法提取的总DNA与2种商业试剂盒一样,在一定程度上能反映微生物群落的多样性和组成。总之,手提DNA方法(Labmethod)所用试剂普通,价格便宜,能在4h以内获得够质够量的土壤DNA用于微生物分子生态学研究,较适合于广大普通实验室进行土壤DNA提取工作。