PCR熔解曲线法检测乙型肝炎病毒变异株

目的 探讨PCR熔解曲线法检测HBVDNA聚合酶活性区YMDD变异的临床应用价值 ,并以DNA测序结果为标准 ,比较其敏感性和特异性。方法 采用DNA测序法和PCR熔解曲线法 ,对拉米夫定抗病毒治疗过程中出现HBVDNA由阴转阳的 6 8例慢性乙型肝炎患者的血清 ,同步进行YMDD变异株的检测。结果 6 8例患者血清中 ,用DNA测序法检出YMDD变异株 5 5例 ,其中YIDD变异 2 5例 (其中 11例伴有L5 2 8M变异 )、YVDD变异 2 4例 (其中伴有L5 2 8M变异 19例 )、YMDD与YVDD共生伴有L5 2 8M变异 1例、YMDD与YIDD共生伴有L5 2 8M变异 5例 ,有 13例未发生YMDD变异 (野生型 )。用PCR熔解曲线法检出YMDD变异株 5 2例 ,其中YIDD变异 2 8例、YVDD变异 2 1例、YMDD与YVDD共生 1例、YMDD与YIDD共生 2例。有 10例未发生YMDD变异 (野生型 ) ,阴性结果 6例。两法变异符合率为 93.88% (46 / 4 9) ;检出符合率为 91.18% (6 2 / 6 8)。结论 采用PCR熔解曲线法进行YMDD变异株的检测 ,其操作方法简便 ,省时 ,不易交叉污染 ,很适用于临床快速诊断和人群筛查。但该法的敏感度和特异性均不如DNA测序法。

荧光PCR熔解曲线法在检测临床标本结核分枝杆菌及其耐药性中的应用

目的评价荧光PCR熔解曲线法检测临床标本结核分枝杆菌及其对利福平和异烟肼敏感性的性能。方法收集重庆市公共卫生医疗救治中心2016年7月至2018年7月进行过荧光PCR熔解曲线法结核检测的病例,分别与结核菌培养和Genexpert比较检测结核菌的灵敏度,与比例法药敏比较药敏结果。结果在结核菌检测上,荧光PCR熔解曲线法阳性率与结核菌培养相近,低于Genexpert;与比例法药敏相比,检测利福平药敏的灵敏度为93.2%,特异度为80.2%,符合率为84.3%;检测异烟肼药敏的灵敏度为92.6%,特异度为86.3%,符合率为88.6%。结论荧光PCR熔解曲线法可以高灵敏地直接对临床样本快速检测结核菌及其耐药性。

荧光PCR熔解曲线法对痰样本结核分枝杆菌耐药性检测价值及耐药特征分析

随着抗结核药物广泛、长期以及不规范使用等因素影响,结核分枝杆菌耐药问题越来越复杂,耐药结核病尤其耐多药结核病(MDR-TB)的发病率日趋增高,耐药性的产生使其具有病程长、病情复杂、治愈率低、病死率高等危害。2020年全球上报耐多药/利福平耐药结核(MDR/RR-TB)13.2万例,准广泛耐药或广泛耐药结核病2.6万例,合计约15.8例,较2019年下降22%,据估算我国耐药结核病发病率居全球前三位[1]。2017年,《肺结核诊断标准》把结核分枝杆菌(MTB)分子生物学检查纳入结核病病原学诊断范围[2]。

荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐药性的临床价值评估

目的:分析评价荧光PCR熔解曲线技术检测结核分枝杆菌异烟肼、利福平、氟喹诺酮类、注射类二线药耐药性的临床应用价值.方法:收集2013年黑龙江省耐药监测结核分枝杆菌临床分离株215例,运用荧光PCR熔解曲线法检测其对异烟肼、利福平、氟喹诺酮类、注射类二线药物的耐药性,以微孔板药敏试验结果为金标准,评估熔解曲线快速检测耐药的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率.结果:荧光PCR熔解曲线法检测利福平的灵敏度90.9%(20/22)、特异度95.85%(185/193)、阳性预测值71.42%(20/28)、阴性预测值98.93(185/187)、符合率95.34%(205/215);检测异烟肼的灵敏度为83.33%(35/42)、特异度91.9%(159/173)、阳性预测值71.42%(35/49)、阴性预测值95.78%(159/166)、符合率90.23%(194/215);检测氧氟沙星的灵敏度为90%(9/10)、特异度100%(205/205)、阳性预测值100%(9/9)、阴性预测值99.51%(205/206)、符合率99.53%(214/215);检测莫西沙星的灵敏度为88.88%(8/9)、特异度100%(206/206)、阳性预测值100%(8/8)、阴性预测值99.51%(206/207)、符合率99.51%(214/215);检测阿米卡星的灵敏度100%(3/3)、特异度100%(212/212)、阳性预测值100%(3/3)、阴性预测值100%(212/212)、符合率100%(215/215);检测卡那霉素的灵敏度80%(4/5)、特异度100%(210/210)、阳性预测值100%(4/4)、阴性预测值99.52%(210/211)、符合率99.53%(214/215).结论:荧光PCR熔解曲线技术检测结核分枝杆菌对异烟肼、利福平、氟喹诺酮类、注射类二线药的耐药性有较好的灵敏性、特异性,检测时间短,可用于辅助耐药结核分枝杆菌快速诊断筛查.

荧光PCR熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用

目的探讨气管镜刷检物实时荧光PCR熔解曲线耐药法检测对复治结核病耐药早期诊断的价值,同时根据支气管刷检深部痰液结核菌耐药检测结果,进一步分析指导可疑耐药结核病治疗,规范临床合理用药,为耐药结核病的诊断及治疗提供科学依据。方法纳入160例结核分枝杆菌(MTB)患者为本研究对象。每例患者采用同一标本进行绝对浓度法和熔解曲线法耐药基因检测,观察熔解曲线法对利福平、异烟肼的检测敏感度、特异度、准确度。结果同一标本应用两种方法检测时,绝对浓度法检出利福平21例耐药,139例敏感;检出异烟肼68例耐药,92例敏感。熔解曲线法检出利福平17例耐药,139例敏感,4例未检出结果;检出异烟肼61例耐药,99例敏感。熔解曲线法对利福平的检测准确度为96.15%、敏感度为87.50%、特异度为98.39%;对异烟腓的检测准确度为95.00%、敏感度为88.57%、特异度为96.80%。两种检验方法对利福平及异烟肼的耐药及敏感率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论荧光PCR熔解曲线法能够快速检测出MTB对药物的耐药基因检测,而且有良好的敏感度和特异度,有效节约时间、安全高效,是临床检验及诊治耐药结核的有效手段。

PCR熔解曲线法在原发性高血压患者中MTHFR677T基因多态性检测中的应用

目的:探讨PCR熔解曲线法检测亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态位点在原发性高血压(EH)诊治中的准确性,并分析血浆Hcy的水平、H型高血压发生率与MTHFR 677C/T基因型的相关性。方法:收治EH患者300例,均采用PCR熔解曲线法进行MTHFR 677C/T基因型检测,并与DNA测序法对比。结果:①与DNA测序法比较,差异无统计学意义(P>0.05)。②MTHFR C677T基因的TT基因型的Hcy水平显著高于CC+CT基因型的Hcy水平,男女差异有统计学意义(P<0.05)。③MTHFR C677T基因的TT基因型较CC+CT基因型H型高血压发病风险显著增加,男女差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PCR溶解曲线法不但操作简单,而且准确率高,进行高血压患者的MTHFR C677T基因型检测有深远的临床意义,可早期预防H型高血压。

微阵列芯片法与荧光PCR熔解曲线法在耳聋基因筛查中的比较分析

目的:观察微阵列芯片法与荧光PCR熔解曲线法应用于新生儿耳聋基因筛查的效果,分析两种新生儿耳聋基因筛查方法的临床诊断价值。方法:选取20例干血斑样本(结果已知),分别使用微阵列芯片法、荧光PCR熔解曲线法进行筛查,验证两种筛查方法的准确性、重复性以及检出限。结果:微阵列芯片法的准确率为100%,重复检测结果与临床已知结果相吻合,核酸浓度稀释到检测下限后的检测结果与已知结果的符合率为100%,满足临床基因筛查的需要。荧光PCR熔解曲线法的准确性验证结果为100%,重复性验证显示各通道Tm值的变异系数(CV)均≤5%,检出限样本的检测结果与已知结果吻合,符合临床筛查要求。结论:在新生儿耳聋基因筛查中,微阵列芯片法与荧光PCR熔解曲线法均能够满足临床筛查的需要,临床应用时可根据实际条件合理选取检测方法。

荧光PCR熔解曲线法在地中海贫血基因突变类型分析中的应用

用荧光PCR熔解曲线法,检测人基因组DNA中缺失型α地贫、非缺失型α地贫和β地贫的常见基因缺失和突变,了解受检者地中海贫血基因突变类型检测阳性率及科室分布情况,分析地贫基因分型结果在贫血诊断、正常妊娠监督产前筛查、遗传咨询中的应用。 方法 利用荧光PCR熔解曲线法对 2017年8月至2021年12月于贵阳市第二人民医院就诊的2401例需做地中海贫血基因检查的患者进行检测,分析地贫基因型的阳性率、基因突变类型及科室分布情况。 结果 2401例患者中缺失型α地贫基因检出319例,检出率13.29%;非缺失型α地贫基因检出34例,检出率1.42%;β地贫基因检出278例,检出率11.58%;缺失型α地贫基因中出现率最高的是 --SEA/αα基因型,非缺失型α地贫基因中出现率最高的是c.427T>C基因型,β地贫基因中出现率最高的是 c.52A>T基因型;其中,缺失型α地贫中有4例复合杂合缺失型(--SEA/-α3.7),有19例α缺失合并β突变;β地贫基因中有1例突变类型不在β地贫试剂盒检测覆盖范围内。 结论 用荧光PCR熔解曲线法检测人外周全血地贫基因,可以明确检测出常见地贫基因突变类型。通过对妊娠期产检孕妇进行地贫基因的遗传筛查,可以发现地贫致病基因携带者,找出有地贫发生高风险的家庭,在产前诊断、遗传咨询、预防疾病、优生优育、提高人口出生质量上有指导作用;除此之外,地贫基因检测还是控制重症地贫患者出生及疾病遗传的有效手段,为寻找贫血原因、制定治疗方案提供科学明确的依据。

荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌对氟喹诺酮类耐药性的临床研究

目的评估荧光PCR熔解曲线法早期诊断结核病患者对氟喹诺酮类(FQs)耐药性的效能,分析FQs耐药情况及特征,为利福平耐药/耐多药结核病(RR/MDR-TB)、准广泛耐药结核病(pre-XDR-TB)规范诊断和选择合理治疗方案提供依据。方法收集2021年1月至2022年8月贵阳市公共卫生救治中心1094例门诊和住院患者涂片阳性标本,行罗氏固体培养法、菌种鉴定,最终589例结核病患者均进行表型药敏试验与荧光PCR熔解曲线法,对利福平(RFP)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、FQs耐药性进行检测;以表型药敏试验为标准,评估荧光PCR熔解曲线法的诊断效能,根据表型药敏试验结果分析患者FQs耐药情况和临床特征的关系。结果荧光PCR熔解曲线法检测结核病患者对FQs耐药性的灵敏度、特异度、符合率、Kappa值分别为91.30%、97.69%、96.94%、0.86,曲线下面积(AUC)为0.945,高于RFP、INH、EMB的0.924、0.923、0.850。RR/MDR-TB患者中FQs耐药率为22.80%,荧光PCR熔解曲线法检测患者对FQs耐药性的Kappa值为0.83,一致性较好,AUC为0.936。荧光PCR熔解曲线法检测不同细菌载量结核病患者对FQs耐药性的灵敏度、特异度、符合率差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗类型、抗结核史、肺部空洞、MDR-TB与FQs耐药有关(P<0.05)。结论荧光PCR熔解曲线法对结核病患者FQs耐药性有较好的诊断效能。

荧光定量PCR探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用研究

探讨在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,观察分析应用价值。方法 本研究的时长段在2022年6月到2023年6月,统共1000例结核患者接受治疗,所有病患都拓展了抗结核药物的测验,且每一位患者的标本均予以荧光定量PCR探针熔解曲线法检测,药物敏感性测定结果为黄金基准,考察判辨荧光定量PCR探针熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的诊断效能。结果 针对1000例的标本中,经过液体药敏试验检测显示对利福平药物耐药例数250例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者;对异烟肼医药有耐药性的液体药敏试验500例,应用溶解曲线检测耐药性包含了470例;经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数170例,予以熔解曲线法显示耐药140例。经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数300例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者。熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的灵敏度分别为84.00%、84.00%、47.06%、66.67%;特异度分别为96.00%、90.00%、84.34%、94.29%;准确度分别为93.00%、97.00%、91.00%、86.00%。结论 在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,可得到较高的应用价值,灵敏度、特异度、准确度较高,可筛查结核病患者对利福平、异烟肼、乙胺丁醇等药物的耐药性,为临床治疗疾病提供可靠的依据。

荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐药性价值及耐药特征分析

目的 评价荧光PCR熔解曲线法(熔解曲线法)对结核分枝杆菌(MTB)耐药性检测价值。方法 采用熔解曲线法与传统液体药敏法同时检测156例临床分离培养MTB对抗结核药物利福平(RFP)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、链霉素(SM)和氟喹诺酮类药物耐药情况,并对2种检测方案结果进行比较。结果 与液体药敏检测相比,熔解曲线法对5种抗结核药物耐药性检测结果差异无统计学意义(P> 0.05),以液体药敏检测为金标准,熔解曲线法检测RFP、INH、EMB、SM以及氟喹诺酮类药物耐药性的灵敏度分别为100.00%、75.86%、61.54%、75.00%、90.00%,特异度分别为97.10%、95.28%、99.30%、96.21%、100.00%,Kappa值分别为0.885、0.721、0.707、0.724、0.944,表明2种检测方法一致性好。结论 荧光PCR熔解曲线法对抗结核药物RFP、INH、EMB、SM及氟喹诺酮类的耐药性与液体药敏法检测效果一致,灵敏度、特异度均较高,具有较好的临床应用价值。

荧光PCR熔解曲线技术在结核病耐药诊断中的应用价值

目的探讨荧光PCR熔解曲线法对痰样本的利福平和异烟肼相关耐药基因的检测效能。方法回顾性分析2019年7月—2020年7月沈阳市第十人民医院收取的254例痰样本检验结果,以BACTEC MGIT 960液体药敏(以下简称MGIT 960药敏)为参考标准,评价熔解曲线法检测利福平、异烟肼耐药性的效能。结果与MGIT 960药敏结果比较,利福平耐药检测的敏感性、特异性和Kappa值分别为89.6%、95.6%和0.83;异烟肼耐药检测的敏感性、特异性和Kappa值分别为81.5%、98.9%和0.85。在初治患者中具有较好的一致性,优于复治患者。结论应用熔解曲线法检测患者痰样本的利福平和异烟肼相关耐药基因,与MGIT 960药敏法比较具有较好的敏感度、特异度和一致性,可快速检测出患者的耐药情况和耐多药结核病(MDR-TB)患者,为临床患者尤其是初治患者提供快速有效的化疗参考方案。

PCR探针熔解曲线法在对肺结核患者进行结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用效果

目的 :探讨PCR探针熔解曲线法在对肺结核患者进行结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用效果。方法 :将2018年1月至2018年3月期间在青海省第四人民医院门诊或住院部接受治疗的20例肺结核患者作为研究对象。使用PCR探针熔解曲线法对这20例患者体内结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素的耐药性进行耐药基因检测。然后,以药敏试验的结果为金标准,观察这些患者体内结核分枝杆菌的耐药基因检测结果与利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素耐药表型的一致性。结果 :这20例患者体内结核分枝杆菌的耐药基因检测结果与利福平、异烟肼耐药表型的一致性较高,其体内结核分枝杆菌的耐药基因检测结果与乙胺丁醇、链霉素耐药表型的一致性较低。结论 :PCR探针熔解曲线法在对肺结核患者进行结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用效果显著,可迅速地筛查出患者体内结核分枝杆菌对利福平等常用一线抗结核药的耐药情况。

多重不对称PCR探针熔解曲线法在一管中检测多个肥胖易感基因方法的建立

目的针对中国人群4个常见的肥胖易感基因位点(FTO基因rs1421085位点、APOA5基因rs662799位点、FABP2基因rs1799883位点、ADRB3基因rs4994位点),建立一种方便、精准、低成本的检测方法。方法结合前期研究中发现的与中国人群肥胖密切相关的4个基因位点,设计引物对、荧光探针以及对应等位基因的靶序列,通过熔解曲线法,验证荧光探针与对应等位基因的靶序列的工作效果,确认不同基因型的熔解温度。采用PCR-Sanger测序法为金标准,对收集的人唾液样本进行检测,选取12个基因型的样本,开发多重不对称PCR荧光探针熔解曲线法进行检测。随后,使用多重不对称PCR探针熔解曲线法与PCR-Sanger测序法分别对200例志愿者的唾液样本进行基因分型检测,比较两种方法的结果与优缺点。结果多重不对称PCR探针熔解曲线法可以在一管中同时对4个常见的肥胖易感基因位点进行检测,准确度与PCR-Sanger测序法相同,且与PCR-Sanger测序法需有扩增、电泳、纯化、s测序的复杂步骤相比,可在一管中一次完成检测,操作更为便捷,且成本更加节省。结论本研究建立了一种针对4个常见肥胖易感基因位点的方便、精准、低成本的基因分型方法,为人群肥胖易感基因的批量筛查提供了一种有效的检测手段。

不同检测方法在骨结核诊断中的应用效果比较

目的:比较利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF,简称"Xpert")、荧光PCR熔解曲线法及液体培养方法在骨结核诊断中的应用效果。方法:收集2017年1月至2018年12月期间166例疑似骨结核患者的脓液标本,分别进行分枝杆菌液体培养(MGIT960培养)、Xpert与荧光PCR熔解曲线法检测。以临床综合诊断为标准,对3种检测方法的敏感度和特异度进行比较分析;以液体药敏为金标准,评价Xpert和荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平耐药的敏感度和特异度。结果:Xpert检测的敏感度分别高于荧光PCR熔解曲线法和MGIT960培养法,荧光PCR熔解曲线法的敏感度高于MGIT960培养法,差异有统计学意义(P<0.05);以MGIT960培养为标准,Xpert的敏感度高于荧光PCR熔解曲线法,差异有统计学意义(P<0.05);Xpert与荧光PCR熔解曲线法的特异度比较,差异无统计学意义(P>0.05);以液体药敏为金标准,Xpert和荧光PCR熔解曲线法检测利福平的敏感度和特异度均为80.0%和100%,两种方法与金标准进行一致性检验Kappa值均为0.872。结论:Xpert和荧光PCR熔解曲线法在骨结核诊断中的敏感性和特异度均优于液体培养方法,两种方法各有千秋,可根据实际情况选择。

2种结核分枝杆菌耐药基因突变检测方法诊断利福平耐药结核病的评估研究

目的评价荧光定量PCR探针熔解曲线法(简称Melt PCR法)和Gene Xpert MTB/RIF技术(简称Xpert法),用于临床涂阳标本诊断利福平耐药结核病(Rifampicin resistant tuberculosis,RR-TB)的检测效能及应用价值。方法随机收集2016年2月至2018年6月在河北省胸科医院就诊肺结核患者结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)涂阳标本278例,应用传统的结核菌比例法药敏试验(对照检测方法)、Melt PCR法和Xpert法同时进行RR-TB情况的检测,分析Melt PCR法和Xpert法检测RR-TB的效能。结果3种方法同时对278例MTB阳性标本的利福平耐药进行检测,耐药检出结果差异无统计学意义(P>0.05)。与传统药敏试验结果相比,Melt PCR法和Xpert法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度和约登指数分别为97.96%、98.25%、92.31%、99.56%、98.20%、96.21%和95.92%、97.38%、88.68%、99.11%、97.12%、93.30%,Kappa值分别为0.940和0.904(P<0.05),均为高度一致。3种方法在痰液中的利福平耐药均显著高于支气管肺泡灌洗液,且差异具有统计学意义(P<0.05)。不同带菌量样本的利福平耐药检出结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论Melt PCR法和Xpert法用于临床涂阳标本中检测RR-TB具有相似的高灵敏度和特异度等检测性能,可结合实际需求在耐多药结核病防治中推广和应用。

海口地区新生儿G6PD基因突变分析

目的了解海口地区新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症的发生率及基因突变特点。方法用荧光斑点法对2016年1月1日至2016年2月24日出生于海口的5 295例新生儿进行G6PD活性筛查,对173例初筛阳性的标本用多色探针荧光PCR熔解曲线法(MMCA)进行基因分型。结果本次筛查发现海口地区新生儿群体的G6PD缺乏症发生率为3.87%(205/5 295),其中男女发生率分别为4.99%(142/2 848)和2.57%(63/2 447)。173例初筛阳性标本中检出142例(82.08%)有基因突变,基因携带率为3.18%(142/5 295/84.39%)。共检出6种基因突变类型,含74例(52.11%)c.1376 G>T,33例(23.24%)c.1388 G>A,13例(9.15%)c.95 A>G,8例(5.63%)c.1024 C>T,4例(2.82%)c.871 G>A,5例(3.52%)c.392 G>T,并检出3例(2.11%)c.1376 G>T复合c.1388 G>A突变、1例(0.71%)c.392 G>T复合c.517 T>C突变、1例(0.71%)c.95 A>G复合c.1388 G>A突变。结论海口地区是G6PD缺乏症高发地区,c.1376G>T、c.1388G>A和c.95 A>G是主要的3种基因突变型。

茂名地区婴幼儿G6PD缺乏症基因突变分析

目的:分析茂名地区婴幼儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症基因突变的类型,为临床上诊断和预防G6PD缺乏症提供依据。方法:从2018~2019年茂名地区G6PD活性筛查阳性召回的婴幼儿中抽取326例采用荧光PCR熔解曲线法进行基因突变检测。结果:326例筛查阳性召回的标本中检出基因突变301例(92.33%),包含10种基因突变类型,由多到少分别为c.1388 G>A(109例),c.1376 G>T(93例),c.95 A>G(33例),c.871 G>A(25例),c.392 G>T(14例),c.1024 C>T(11例),c.1360 C>T(3例),c.517 T>C(2例),c.1004 C>A(2例),c.487 G>A(1例);同时检出c.1376 G>T复合c.1388 G>A突变3例,c.1388 G>A复合c.871 G>A突变2例,c.1376 G>T复合c.392 G>T突变1例,c.95 A>G复合c.1024 C>T突变1例,c.1388 G>A复合c.1024 C>T突变1例。结论:茂名地区的G6PD基因突变以c.1388G>A、c.1376G>T和c.95A>G为主要类型,该研究为本地区流行病学调查、临床上诊断和预防G6PD缺乏症提供了有价值的参考依据。

上海地区幽门螺杆菌对克拉霉素耐药的相关基因检测

目的通过荧光PCR熔解曲线方法直接检测临床样本中幽门螺杆菌(Hp)对克拉霉素耐药基因,了解上海地区Hp耐克拉霉素基因的分布特征,并为临床快速检测Hp对克拉霉素耐药性提供一种有效的方案。方法收集2017年9-12月复旦大学附属中山医院消化科就诊并接受胃镜检查的快速尿素酶试验Hp阳性患者的胃黏膜组织标本80份,使用荧光PCR熔解曲线法直接检测黏膜样本中Hp种特异性23SrRNA的区域并对扩增的核酸进行荧光标记,通过检测荧光变化绘制其熔解曲线,以确定Hp的23SrRNA突变情况;采用DNA测序技术直接检测标本中Hp克拉霉素23SrRNA耐药基因突变位点。并对两种方法的结果进行Kappa检验统计学比较。结果80份胃黏膜组织标本使用荧光PCR熔解曲线法共检测69份Hp阳性,11份Hp阴性,阳性率为86.2%。在69份Hp阳性标本中24份标本存在23SrRNA第2142或2143位点的变异,突变率34.8%。使用DNA测序法共检测出64份Hp阳性,阳性率为80.0%。其中23例患者的标本检测到23SrDNA耐药基因的突变,突变率35.9%。两种方法检测Hp耐药基因突变的阳性符合率、阴性符合率和总符合率分别为87.0%、95.1%和92.2%,Kappa系数为0.829,两者一致性较好。结论上海地区克拉霉素耐药Hp菌株基因型以23SrRNA基因的A2143G突变占主导。荧光PCR熔解曲线法可直接检测胃黏膜活检组织中Hp及其23SrRNA突变基因,该方法结果准确可靠。

中国西南三区216例儿童葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因型分布和临床特征分析

目的了解葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症患者基因突变型在四川(川)、云南(滇)、贵州(黔)三地区的分布情况及临床特征,为该病的临床诊治提供实验室依据。方法对来自川滇黔疑似G6PD缺乏症的汉族患者450例(男342例,女108例),采用多色探针荧光PCR熔解曲线法进行G6PD基因型别检测,并分析基因突变类型与临床表型之间的关系。结果450例可疑样本中,检出215例(男172例,女43例)单基因突变和1例含1388G>A和1004C>A复合型突变。11种单基因突变型所占比例分别为:1388G>A型29.78%;1376G>T型24.65%;1024C>T型22.33%;95A>G型12.09%;871G>A型4.05%;392G>T型2.33%;517T>C型1.39%;487G>T型0.93%;1004C>A型0.93%;1387C>T型0.47%;1360C>T型0.47%。川、滇和黔三地优势基因均为1388G>A、1376G>T和1024C>T型。男女患儿前两位突变位点均为1388G>A(26.7%,41.9%)和1376G>T(26.2%,18.6%),1024C>T(25.0%)居男性患儿第3位,女性第3位则为95A>G(14.0%)。<1岁的患儿以1024C>T(28.0%)、1388G>A(25.6%)和1376G>T(25.0%)型为主,>1岁的患儿以1388G>A(43.1%)、1376G>T(23.5%)和95A>G(15.7%)为主。男性患儿酶活性明显低于女性患儿,各基因突变型在同一性别之间酶活性差异无统计学意义(F=0.680、1.629,P=0.666、0.177)。肝肿大、贫血、黄疸和尿色改变为主要的临床表现,不同基因型与临床表现之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论川、滇、黔三地区汉族人群中G6PD缺乏症患儿基因突变型以1388G>A、1376G>T和1024C>T为优势突变基因,呈多样化分布。突变型可能与性别和首次发病年龄有关,各突变型之间没有明显的临床表现和酶活性差异。