sARMS-PCR检测非小细胞肺癌肿瘤组织中KRAS、BRAF基因突变研究

目的针对非小细胞肺癌(NSCLC)患者组织标本鼠类肉瘤病毒癌基因同源基因(KRAS)和鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)驱动基因突变使用特异引物双扩增实时蝎形探针扩增阻滞突变系统(sARMS-PCR)检测的可行性;了解KRAS和BRAF基因突变患者临床病理特征,为NSCLC患者个体化治疗提供理论依据。方法收集89例NSCLC患者肿瘤组织甲醛固定石蜡包埋标本(FFPE),采用FFPE样品DNA分离试剂盒(离心柱型)提取DNA,使用sARMS-PCR同时进行KRAS及BRAF基因突变检测。结果1 KRAS基因突变21例(21/89);其中KRAS基因7种热点突变中,检出6种热点突变,均位于第12、13位密码子,1例同时检出存在G12D及G12V位点突变,1例同时检出存在G12C及G12V位点突变;未发现G12S突变型;2 BRAF基因突变1例(1/89),突变位点为V600E,为女性,黏液腺癌;3未见KRAS和BRAF基因同时突变现象。结论临床使用sARMS-PCR技术检测NSCLC患者KRAS和BRAF基因突变有较强敏感性,且石蜡组织标本取材方便,可以作为两种基因的临床检测方法;KRAS和BRAF基因突变与年龄、吸烟史、病理分型等均无明显相关性,KRAS基因突变与性别相关,男性高于女性;KRAS与BRAF基因是独立存在的。

番茄LE-ACC_2合酶基因5′端前导序列分离方法的研究

通过ＰＣ／Ｇｅｎｅ软件对 Ｒｏｔｔｍａｎｎ等人发表的番茄 ＬＥ－ＡＣＣ２合酶的 ５’端 ２．０ Ｋｂ的前导序列作分析，设计了４对特异引物；以番茄果实、叶片的总ＤＮＡ为模板，采用特异ＰＣＲ扩增技术获得了 ２．０， １．８７， １．５８， １．２８ Ｋｂ ４个特异片段，用 Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ技术构建了１个克隆（２．０ Ｋｂ）、３个亚克隆（１．８７，１．５８，１．２８ Ｋｂ），对４个克隆产物进行了 ＤＮＡ序列测定，借助 ＰＣ／Ｇｅｎｅ软件对所获得的各克隆序列进行综合处理与分析，获得了番茄 ＬＥ－ＡＣＣ２ ５’端前导序列的同源率为９９．９％，但第－９７９位的 Ｃ和第－１０７６位的 Ｔ分别为 Ｔ和 Ｃ所替代。对利用 ＰＣＲ技术分离大片段ＤＮＡ的各环节作了较详细的研究。

非小细胞肺癌患者eml4-alk基因检测及eml4-alk阳性患者临床特征分析

目的探讨棘皮动物微管相关蛋白4(eml4)与间变性淋巴瘤激酶(alk)融合基因阳性非小细胞肺癌(NSCLC)患者的检测、临床特征、治疗、预后以及与egfr、kras、braf基因表达情况之间的联系。方法选取190例NSCLC患者石蜡包埋(FFPE)标本,采用免疫组化(IHC)法进行eml4-alk融合基因阳性NSCLC患者(eml4-alk+NSCLC)筛选,对于IHC阳性的标本使用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测验证。收集整理eml4-alk+NSCLC的临床资料,并对其随访;对所有患者标本采用RT-PCR法进行egfr、kras、braf突变检测。结果190例NSCLC患者中,经IHC筛查及RT-PCR确证,共检出17例eml4-alk+NSCLC,其中手术标本最多,占47.1%(8/17)(χ~2=25.999,P=0.000),<60岁的占76.5%(13/17)(χ~2=5.813,P=0.016)。未显示eml4-alk融合基因与egfr、kras或braf突变同时出现的患者。在手术患者Ⅰ期未显示eml4-alk阳性肺癌,在Ⅱ~Ⅲa期检出8例eml4-alk阳性肺癌,经术后化疗25%(2/8)复发,2年生存率为100%。9例晚期eml4-alk阳性肺癌患者化疗有效率低(4疗程化疗后仅12.5%缓解),已有5例死亡。一线化疗后病情稳定或缓解的患者维持阶段口服克唑替尼的客观缓解率(ORR)与疾病控制率(DCR)分别达50%、100%。多线治疗后进展患者三线口服克唑替尼2个月ORR与DCR仍可达33.3%、66.7%。结论通过IHC筛查及随后RT-PCR可在各种病理标本中有效检出eml4-alk+NSCLC,其临床特征为<60岁的患者多见,而与性别、吸烟史等其他特征无明显关联。能够手术的较早期(Ⅱ~Ⅲa期)eml4-alk+NSCLC,接受术后辅助化疗预后较好;晚期患者一线化疗后病情稳定或缓解患者口服克唑替尼疗效较好。经多线治疗后使用克唑替尼仍然可提高其ORR及DCR,但获益有限。

瓢鸡3个防御素基因（AvBD4、AvBD5、AvBD14）的Bi-PASA分子标记与沙门菌易感性的相关性研究

研究以3个防御素基因(AvBD4、AvBD5、AvBD14)为鸡沙门菌易感性候选基因,以瓢鸡成年鸡沙门菌阳性群体与阴性对照群体为研究对象,采用序列测定和双向PCR扩增特异等位基因标记(Bi-PASA)技术,分析了3个防御素基因变异与沙门菌易感性的相关性。结果显示:在瓢鸡每个防御素基因编码区均检测到一个引起氨基酸变异的多态位点,分别建立了3个防御素基因的Bi-PASA分子标记;AvBD5基因A799G位点与瓢鸡沙门菌易感性的相关性达到极显著水平(P=0.0039),AvBD14基因的A2096T位点达到显著水平(P=0.017),而AvBD4相关性不显著(P=0.599);根据比值比(OR)与95%CI确定了每个防御素基因的保护基因型与易感基因型。研究结果对阐明防御素基因与沙门菌易感性的关系以及建立沙门菌抵抗力鸡群具有重要意义。

非缺失/重复型Duchenne肌营养不良症患者的致病点突变分析

目的检测非缺失/重复突变型Duchenne肌营养不良症(Duchennemusculardystrophy,DMD)的致病点突变。方法对6个家系的6个无关DMD男性患者的DMD基因的79个外显子及5′-、3′-非翻译序列进行PCR扩增,产物通过变性高效液相色谱(denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)技术进行突变筛查。结果6例非缺失/重复突变型Duchenne肌营养不良症患者,检测出了5例患者的致病点突变,即697-698insGT,C616T,G1255T,C4279T和C2302T。第1个点突变引起移码突变,后4个致病点突变引起翻译的提前终止,最终导致Duchenne肌营养不良症。患者3除致病点突变外,在第39内含子还发现1个T5586+61A点突变;患者5还检测出了一个位于第8外显子的错义突变;而没有检出致病点突变的患者6,发现了2个外显子突变及2个内含子序列点突变,即C2168+13T、G5234A、C5280T和5740-13dupG。所有检出的突变有7个点突变未见报道。结论变性高效液相色谱技术结合测序,可用于检测DMD患者的点突变,该方法具有准确、灵敏的特点。