GJB2全序列长链PCR和琼脂糖凝胶电泳方法研究

目的：探讨GJB2全序列长链PCR方法和琼脂糖凝胶电泳方法，以及影响长链PCR和电泳结果的可能因素。方法应用Primer Premier 5.0软件和Oligo 6 Demo软件针对GJB2全序列设计引物，应用DNA聚合酶KOD FX Neo试剂盒进行两步法长链PCR扩增，调整加入DNA模板量、PCR延伸时间、循环次数等影响PCR产物量，通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物长度和量，调整加样槽的宽度、加样量、电泳电压、电流、电泳时间得到清晰条带，若PCR产物存在大片段碱基插入或缺失，用限制性内切酶BamHI进行内切酶反应，初步判断插入或缺失的大致位置。结果正向引物F：5’-AGATCGGGACCTCGAAGGGGACTTG-3’；反向引物R：5’-AGGTGGGCACGGGGTTAGGTAGAAA-3’，扩增片段长5887 bp。长链PCR条件为：50μl的反应体系中加入2μl（约40 ng）的基因组DNA，预变性94℃2分钟，变性98℃10秒，68℃延伸5分钟，共32个循环。电泳条件为：加样槽5 mm宽，每槽加样0.8μl PCR产物，电泳电压50 V，电流50 mA，电泳时间140分钟。结论应用DNA聚合酶KOD FX Neo试剂盒进行两步法长链PCR，可进行GJB2全序列扩增，影响PCR的可能因素为引物、DNA模板的质和量、延伸时间、循环次数等。0.8%琼脂糖凝胶电泳可获得较好的分离效果，影响电泳可能的因素为加样槽宽度、加样量、电泳电压、电流、电泳时间等。

琼脂糖凝胶电泳法测定血清中各种脂蛋白胆固醇

对琼脂糖凝胶电泳法同时测定血清极低密度脂蛋白（ VLDL）、低密度脂蛋白（ LDL）、高密度脂蛋白（ HDL）和脂蛋白 (a)[Lp(a)]的胆固醇 [即 VLDL- C、 LDL- C、 HDL- C和 Lp(a)- C]含量的方法进行评价。方法采用 Helena REP全自动快速电泳系统分离血清 VLDL、 LDL、 HDL和 Lp(a)，然后结合胆固醇酶染色法同时测定 VLDL- C、 LDL- C、 HDL- C和 Lp(a)- C的含量。分析了该法的精密度、准确度和干扰因素，并将该法与传统方法如测定 HDL- C的磷钨酸-镁沉淀法（ PTA- Mg2＋法）、测定 LDL- C的聚乙烯硫酸沉淀法（ PVS法）及测定 Lp(a)的免疫透射比浊法（ ITA法）进行比较。结果电泳法测定 VLDL- C、 LDL- C和 HDL- C的批内 CV分别为 5.16％～ 7.46％、 1.26％～ 3.28％、 3.78％～ 5.86％；批间 CV分别为 8.35％～ 11.25％、 2.78％～ 4.08％、 4.23％～ 6.36％。检测线性范围总胆固醇为 1.04～ 10.35 mmol/L，基本不受溶血、黄疸和脂血干扰。 VLDL- C、 LDL- C和 HDL- C的平均回收率分别为 90.3％、 94.3％和 89.6％。电泳法与传统法测定 LDL- C、 HDL- C的相关系数（ r）分别为 0.9609、 0.9557。电泳法测定 Lp(a)- C与 ITA法测定 Lp(a)的 r为 0.9235。以该法检测北京地区 98例健康人， HDL- C、 VLDL- C、

琼脂糖凝胶电泳法测定糖化血红蛋白及其临床应用

目的 采用琼脂糖凝胶电泳的方法测定糖化血红蛋白 (Hb Alc) ,了解 Hb Alc与空腹血糖的关系。方法 取正常人及糖尿病人 EDTA- K2抗凝全血 2 32例 ,制成血红蛋白溶液 ,使用法国 sebia公司 sebia HYDRASYS电泳仪及光密度计扫描仪 ,用琼脂糖凝胶进行电泳分离和光密度计扫描定量测定 Hb Alc;在全自动生化分析仪上用己糖激酶法测定空腹血糖。结果 对照组的 Hb Alc平均值 (% )为 x± s=5 .4 1± 0 .94 ,血糖的平均值 (mmol/ L )为 x± s=4 .92± 0 .87;糖尿病人的 Hb Alc平均值 (% )为 x± s=11.0 6± 4 .3,血糖的平均值 (mmol/ L )为 x± s=10 .86± 3.0 4 ,P<0 .0 1,血糖值与Hb Alc值有显著相关性 ,r=0 .985 ,回归方程 Y=1.10 15 x+1.815。结论 该方法标本用量少 ,分辨率高 ,重复性好 ,结果不受温度及胎儿血红蛋白的影响 ,Hb

一种基于琼脂糖凝胶电泳法检测SARS-CoV-2的新方法

鉴于琼脂糖凝胶电泳分析方法的准确、快速、简便等特性,优化后可以做为检出COVID-19病原的新方法。在不影响结果判读的情况下,通过对扩增时间及检测样本浓度进行优化,以达到预期目的。结果表明,检测SARS-CoV-2的最优反应程序为94℃预变性3 min;94℃变性时间、56℃退火时间及72℃延伸时间均降至5 s,且进行35个循环;最后72℃孵育5 min,最优模板用量比例(初始值设为4 ng)下限调整在(1:1000)^(1:5000)范围内。阳性样本测试结果符合预期。建立了一种简便、省时,适用于检测低载量病毒样本的新方法,为临床提供诊断参考。

琼脂糖粉的质量对PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳的影响

目的:研究琼脂糖粉的质量对聚合酶链式反应(PCR)产物琼脂糖凝胶电泳的影响。方法:PCR产物琼脂糖凝胶电泳中分别使用不同牌子的琼脂糖粉,同时跑胶图像。结果:质量差的琼脂糖粉电泳结果有明显弥散现象,而更换高质量的琼脂糖粉,未见弥散现象。结论:琼脂糖粉质量在分子生物学PCR产物琼脂糖凝胶电泳实验中扮演重要角色,使用高质量的琼脂糖粉对实验的成功至关重要。

琼脂糖凝胶电泳法测定小麦中长穗偃麦草的基因

为了验证琼脂糖凝胶电泳法检测小麦中长穗偃麦草基因的可行性,选取了小麦品种新春37与长穗偃麦草的杂交后代XC10、XC31、XC35,利用DNA提取、构建PCR体系、PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳等方法来检测其相关基因。并验证该方法对小麦相关基因检测的准确度和重现性。结果显示,该方法操作简单、准确度高,可用于小麦基因的检测分析。

高效液相色谱法与琼脂糖电泳法检测β-地中海贫血携带者HbA_2结果的比较

目的比较高效液相色谱法(HPLC)与琼脂糖电泳法检测β-地中海贫血携带者HbA2的结果,探讨二者筛查β-地中海贫血的灵敏性和可靠性。方法产前筛查疑似β-地中海贫血携带者154例,同时检测β-地中海贫血基因、HbA2。HbA2分析采用法国Sebia琼脂糖凝胶电泳系统和HPLC分析系统同时进行分析。β-地中海贫血基因诊断采用反向点杂交法进行17种常见突变基因检测,以基因诊断结果作为金标准分别对HPLC分析仪和琼脂糖电泳的HbA2结果进行评价分析。结果在154份临床样本中,基因诊断为阳性的样本为65例;以HbA2>3.5%作为诊断β-地中海贫血携带者的最佳临界值,琼脂糖电泳共筛查出57例阳性,与基因诊断符合率为87.6%;HPLC分析共筛查出63例阳性,与基因诊断符合率为96.9%;琼脂糖电泳与HPLC分析仪诊断β-地中海贫血的灵敏性、特异性分别为84.6%、97.7%、96.9%及98.9%。HPLC分析仪阳性符合率、灵敏性明显高于琼脂糖电泳,差异有统计学意义(P<0.05);而HPLC特异性也稍高于琼脂糖电泳法,但比较无显著差异(P>0.05)。结论 HPLC筛查β-地中海贫血与基因诊断有较高的符合率,是一种筛查β-地中海贫血灵敏性、特异性和准确度都较高的理想方法。

DNA片段的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验组织与安排

DNA扩增和DNA琼脂糖凝胶电泳实验首次推广到中学课程教学中。由于中学课时有限、班级人数多、试剂微量、试剂价格较高等诸多实际情况的制约，教学实验组织、指导和安排显得更为重要。在川布兰公司的大力支持下，2009年我校9个班近400个学生顺利完成了此项实验。每班40人共分8个小组，先做琼脂糖凝胶电泳实验（用上一个班所扩增的样品），再做DNA片段的PCR扩增实验，最后观察核酸条带。扩增前模板质粒由学生加入，在实验准备和安排上，尽量给每一个学生操作的机会。此次实验所用试剂盒为川布兰公司提供，总计费用878元。

乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳的改良

临床实验室测定乳酸脱氢酶（ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＬＤＨ）同工酶的方法目前分为二类，一类是应用免疫抑制法在自动生化分析仪上测定，另一类是做各种载体的电泳来分离区带。我们对醋酸纤维膜和琼脂糖两种载体进行实验，改良了琼脂糖凝胶电泳的方...

琼脂糖凝胶中DNA的一种长期保存法

有时因时间仓促或另有要事不能及时将凝胶电泳结果照相,有时需要将凝胶板留作参考或比较,这些都要求保存凝胶电泳中的DNA条带,防止DNA的扩散。常规的方法是将凝胶板置于10％乙醇4℃保存,但这种方法仅能减缓DNA扩散。澳大利亚新威尔士大学微生物学与免疫学院David Jacobs等发明了一种长期保存琼脂糖凝胶中DNA的方法。此法非常简便。

用普通琼脂糖代替低熔点胶回收DNA片段

为了建立一种直接从普通琼脂糖凝胶中回收DNA片段的简便实用的方法 ,采用聚合酶链式反应扩增人P53基因外显子7、8和其间的内含子7序列 ,用普通琼脂糖凝胶电泳,直接从凝胶中切下产物带 ,用加热熔化法回收DNA ;紫外比色法测定回收率 ;用测序法鉴定回收产物质量。并用QIAquickSpin纯化柱对照。结果表明 ,本法回收的产物质量明显优于用QIAquickSpin柱回收 ,本法回收的产物用于测序效果极佳 ,回收率达80% ,用QIAquickSpin柱回收率不到20% ,差异非常显著(P<0 01)。证明这种方法回收PCR产物质量可靠 ,能代替低熔点胶回收DNA 。

碱裂解法提取重组质粒DNA及PCR验证

目的:筛选获得高质量质粒,为进一步克隆、测序奠定基础。方法:采用常规的碱裂解法从大肠杆菌重组质粒中提取质粒DNA,核酸检测仪测定提取质粒DNA产量和纯度,并用前期DDRT-PCR时采用的引物进行PCR验证性实验,琼脂糖凝胶电泳检测,并对电泳图谱加以分析和鉴定。结果:利用常规的碱裂解法提取重组质粒,通过酚和氯仿的抽提,可以有效地去除蛋白质杂质,用含有RNase抑制剂的无菌水溶解质粒提取效果最好,得到的质粒DNA无RNA污染,纯度比较高,OD260/OD280比值介于1.8～2.0之间,OD260/OD230比值大于2.0,经PCR反应验证后与预计相符。结论:通过该方法获得的重组质粒纯度和浓度都比较高,且PCR验证与预计相一致,可以满足后续分子生物学实验的要求。

一种简便有效的PCR扩增片段直接回收克隆方法

作者提供一种简便快速的克隆方法,即直接对琼脂糖凝胶电泳分离的PCR产物进行克隆,可获得较高的阳性克隆率.结果显示,300～700 bp大小的片段阳性克隆率为70.72%,300 bp以下和大于700 bp的片段阳性克隆率分别达到60.38%和45.33%.该方法适用于含有大量不同大小DNA片段的PCR产物并需要同时对其进行回收和克隆的样品,不仅可以大大简化实验过程,也可以降低假阳性出现的机会.

肝素样品前处理方法比较及荧光定量PCR法鉴定肝素原料种属来源

目的比较肝素原料的3种前处理方法,即磁珠吸附法、琼脂糖凝胶回收法和肝素酶降解法的优劣,并对肝素原料的种属来源进行鉴别。方法分别用磁珠提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒和肝素酶对肝素原料进行前处理,用商业化的猪、牛、羊种属鉴别试剂盒进行检测。采用荧光定量PCR法对3批肝素原料进行种属来源的鉴别,同时对猪源肝素中掺入的不同比例羊源肝素进行检出限的检测。结果 3种不同的前处理方法以肝素酶降解法最快捷、最省时和最经济;种属来源鉴别结果准确。荧光定量PCR法检测猪源肝素中掺入羊源肝素的检出限是0.01%。结论肝素酶降解法能简捷、快速、经济的解决肝素原料中样品前处理的技术难点,结合商业化的猪、牛、羊鉴别试剂盒与荧光定量PCR仪能够简便、快速、准确的对肝素原料种属来源进行鉴别。

简便快速的PCR产物回收方法

目的 分析比较几种PCR产物回收方法的回收效果。方法 针对PCRDNA的回收效果及回收特点 ,采用内皮素 (Endothelin)基因PCR反应产物 ,分别利用本室建立的二种新方法———速冻 -快速离心法、凝胶浸泡法和传统方法———玻璃珠试剂盒回收法对PCR产物DNA进行回收 ,用琼脂糖凝胶电泳鉴定 3种方法回收PCR产物的效果。结果 发现两种新方法回收DNA带的亮度强 ,与传统方法相比 ,差异无显著性 (P >0 .1 0 )。结论 说明速冻 -快速离心法与凝胶浸泡法不仅具有玻璃珠试剂盒回收PCR产物的效果 ,而且经济、方便、可靠 。

用三引物法提高PCR的扩增效率及特异性

聚合酶链反应(PCR)现已广泛应用于分子生物学研究的各个领域。对于模板量较低的样品及单拷贝基因,通常通过增加扩增的次数或多次PCR提高扩增的效率,但这样往往出现非特异性反应。本文采用三引物双扩增法大大提高了PCR扩增的效率及特异性。 1 材料与方法 Melanoma细胞由本室保存,能分泌人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)。RT

PCR及电泳实验的单课时解决方案

“多聚酶链式反应扩增DNA片段”在高中生物新课程中占有重要的地位，但是PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳的实验过程通常需要2h～3h才能完成，所以很难满足中学课时紧的要求，从而阻碍了在中学教学中的推广。针对以上问题，北京川布兰生物技术开发有限公司从研制相关试剂盒出发，将PCR扩增（21min）和琼脂糖凝胶电泳（5min-10min）控制在30min之内完成，从根本上解决了实验过程繁琐耗时长的问题。