Sanger测序和AMRS-PCR检测ALDH2基因突变结果的比较

目的比较Sanger测序法与扩增阻滞突变系统PCR(ARMS-PCR)在检测患者线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因突变方面的差异。方法将2019年10月至2020年1月于陆军军医大学第一附属医院治疗的350例有冠心病、心肌梗死、心绞痛、原发性高血压病史的患者纳入研究,收集受试者外周血标本。用Sanger测序法与ARMS-PCR法检测ALDH2基因突变,分析两种方法检测结果的差异。结果两种方法检测ALDH2基因突变的总突变率均为33.1%,AA纯合型突变率为3.7%,GA杂合型突变率为29.4%。两种方法检测结果的总符合率为100.00%,突变型阳性符合率和阴性符合率均为100.00%,ARMS-PCR法与Sanger测序法对临床标本的检测结果一致性较好(Kappa≥0.7,P<0.05),具有等效性。另外,ARMS-PCR法检测出的ALDH2基因型分布情况与性别、年龄无关(P>0.05)。结论Sanger测序法和ARMS-PCR法均可准确、有效地检测ALDH2突变情况,但基于成本优势和操作简便的原则,ARMS-PCR法在临床实践中更具优势。

利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术检测水稻低直链淀粉含量基因Wx-mq

根据Wx-mq基因存在的单核苷酸变异,利用四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra-primer ARMS-PCR)的方法设计特异引物,对12个水稻品种(或品系)以及武育粳3号(不含Wx-mq基因)/关东194(含Wx-mq基因)的F2分离群体进行扩增,依据其PCR产物的带型,可以准确区分出Wx-mq基因纯合、非Wx-mq基因纯合以及杂合基因型三种类型,其电泳结果与成熟后对胚乳外观特性鉴定完全一致。因此,作为一种简单、低成本的实用技术,四引物ARMS-PCR可以广泛用于Wxmq基因水稻的资源鉴定和分子标记辅助育种。

大引物PCR定点突变方法的改进

对大引物PCR定点突变方法进行改进,主要包括:避免在一个PCR反应中同时使用扩增全长基因的常规引物,选择不同载体克隆原始基因和突变基因,通过抗性选择筛选突变子,从而完全避免原始基因的干扰.实验结果证明利用改进后的方法进行基因点突变,可以减少操作步骤,提高突变频率.

四引物扩增受阻突变体系PCR快速测定绵羊BMPR-IB基因型方法的建立

四引物ARMSPCR是检测SNP有效、快速、简便的方法。绵羊BMPRIB基因是控制Booroola绵羊多胎性状的主效基因,此研究目的在于建立一种对BMPRIB基因四引物ARMSPCR检测方法。根据四引物ARMSPCR技术原理,在绵羊BMPRIB基因突变位点(A746G)设计一对特异性引物,并在突变点两侧设计一对参照引物,用来扩增含有突变点的DNA片段,可在一步PCR反应中根据电泳图谱准确判断绵羊个体的BMPRIB基因型,对比PCRRFLP检测结果表明,所建立的方法简单,操作简便,大大提高了检测效率。

四引物扩增受阻突变体系PCR技术在中国明对虾SNP基因分型中的研究

采用四引物扩增受阻突变体系PCR（Tetra-primer ARMS-PCR）技术,对中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）的80个单核苷酸多态性位点（Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs）进行验证。结果表明,通过优化PCR反应条件、调整内外引物浓度和采取Touchdown PCR程序可优化扩增效果,80组引物中有20组引物得到良好的分型效果。群体多态性分析表明有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）及多态性信息含量（PIC）的范围分别为1.127~1.993、0.136~0.607、0.119~0.492和0.145~0.373。结果显示四引物扩增受阻突变体系技术聚合酶链式反应是一种简单快速而有效SNP基因分型的方法。

PCR-SSCP检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的筛检试验评价

目的:评价PCR-SSCP筛检非小细胞肺癌(NSCLC)ECFR基因突变的临床应用潜力。方法:分别采用DNA测序法和PCR-SSCP分析对一定数量的NSCLC标本进行EGFR基因突变检测,以DNA测序结果为金标准,计算PCR-SSCP法的灵敏度、假阴性率、特异度、假阳性率、约登指数、粗符合率、预测值和似然比等指标;同时随机抽取20%的样本,重新进行PCR-SSCP分析,计算两次结果的Kappa指数值。结果:PCR-SSCP分析的灵敏度为97.2%,假阴性率为2.8%,特异度为94.3%,假阳性率为5.7%,约登指数为0.915,粗符合率为94.8%,阳性预测值为77.8%,阴性预测值为99.4%,阳性似然比为17.1,阴性似然比为0.5,前后两次PCR-SSCP分析的Kappa指数值为0.81(P<0.05)。结论:PCR-SSCP检测NSCLC EGFR基因突变具有较高的真实性、可靠性和实用性。

一种SNP检测新方法:四引物扩增受阻突变体系PCR技术

详细介绍四引物扩增受阻突变体系PCR技术的原理和分析方法 ,并简单介绍其在检测单核苷酸多态性中的应用 ,为该技术在医学和分子生物学等领域中的推广应用提供理论基础。

利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术检测水稻光温敏核不育基因p/tms12-1

根据p/tms12-1基因存在的单核苷酸变异,利用四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra-primer ARMS-PCR)的方法设计特异引物,对11个两系不育系水稻品种(或品系)以及2个常规稻品系进行扩增。根据其PCR产物带型,可以准确鉴定光温敏核不育基因p/tms12-1的基因型,其检测结果与通过CAPS标记检测的结果完全一致。该方法成本低、简单、可靠,可用于p/tms12-1基因的鉴定和分子标记辅助育种。

四引物扩增受阻突变体系PCR在绵羊线粒体基因组SNP检测中的应用

为建立绵羊线粒体基因组SNP的四引物扩增受阻突变体系(tetra-primer amplification refractory mutation system,Tetra-primer ARMS)PCR检测方法,选择小尾寒羊线粒体T1112C和C11606T2个SNP,在等位基因特异PCR基础上,根据错配原理设计4条引物,优化PCR反应体系,采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果表明:T1112C位点检测中,所有个体均能扩增出569 bp最长片段的外引物产物(阳性对照),扩增出349 bp片段的个体为野生型,扩增出263 bp片段的个体为突变型。C11606T位点检测中,所有个体均能扩增出572 bp最长片段的外引物产物(阳性对照),扩增出408 bp片段的个体为野生型,扩增出213 bp片段的个体为突变型。在每个线粒体多态位点均检测到野生型和突变型2种基因型,没有发现异质性。应用Tetra-primer ARMS PCR方法,经一次PCR即可判定线粒体SNP位点的基因型,该方法快速、简便,可应用于绵羊线粒体SNP分型。

突变体富集PCR法检测非小细胞肺癌病理组织EGFR基因突变

目的:建立突变体富集PCR法检测非小细胞肺癌病理组织中的EGFR基因突变。方法:选取55例细支气管肺泡癌和59例非小细胞肺癌病理组织蜡块,提取基因组DNA,采用不同的突变体富集PCR法(PCR-PAGE和PCR-RLFP)检测EGFR基因常见的19和21外显子突变,并经过直接测序验证。结果:在59例非小细胞肺癌中共检测出EGFR基因突变22例,突变率为37·3%(22/59)。55例细支气管肺泡癌中共检测出24例基因突变,突变率为43·6%(24/55)。经直接测序验证,EGFR19外显子有3种类型缺失突变。EGFR21外显子的错义突变为L858R。结论:突变体富集PCR法准确、快速、经济,便于临床筛查非小细胞肺癌病理组织中的EGFR基因突变。

耐氟喹诺酮类药物大肠埃希氏菌基因突变的MAMA-PCR检测

采用MAMA-PCR法对72株已知突变菌株的突变情况进行了检测。结果,有2种gyrA 83位突变:TCG→TTG和TCG缺失;4种gyrA 87位突变:GAC→AAC、GAC→GGC、GAC→TAC和GAC→CAC;1种parC 80位突变:AGC→ATC以及4种parC 84位突变:GAA→AAA、GAA→GCA、GAA→GGA和GAA→GTA。采用同样的方法,对38株未知突变菌株的检测结果显示,gyrA 83、gyrA 87、parC 80和parC 84位的突变检出的正确率分别为97．4％、94．7％、81．6%和94．7％。结果表明,MAMA-PCR有望成为监测耐氟喹诺酮类药物大肠埃希氏菌的分子生物学常规方法。

应用ARMS- PCR法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变及其临床意义

目的探讨依据ARMS法原理,采用实时荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的可行性并分析检测的临床意义。方法收集苏州大学附属第三医院2010年9月至2011年12月确诊为NSCLC患者标本64例,DNA提取后,采用ARMS-PCR法对标本进行EGFR基因突变检测并分析EGFR基因突变与患者临床病理参数的关系。结果本研究发现64例NSCLC患者的EGFR总突变率为23.4%,均为19号外显子缺失(19-Del)和21号外显子(L858R)突变;女性EGFR突变率高于男性,腺癌高于鳞状细胞癌。结论 EGFR基因突变检测有助于规范表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)在NSCLC患者中的临床应用。

萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP_2基因PCR定点突变及其在大肠杆菌中的表达

根据已报道的萝卜抗真菌蛋白Rs AFP2 基因序列 ,结合基因及其表达调控中遗传密码的偏爱性 ,人工合成引物 ,利用PCR重叠延伸法 ,使编码序列区的部分核苷酸突变 ,采用嵌套PCR ,迅速克隆到目的基因片段Rs AFPm ,连接到 pGEM Teasy载体上 ,转化大肠杆菌XL1菌株 ,筛选到阳性克隆。序列分析结果表明 ,PCR产物全长 2 40bp ,有一个阅读框 ,编码 2 9个氨基酸的信号肽和 5 1个氨基酸的抗真菌蛋白 ,与突变前的Rs AFP2 基因相比 ,在编码区第 3号氨基酸Lys相差一个碱基 (TTG→TTA) ,第 5号氨基酸Gln相差一个碱基 (CAG→CAA) ,第 6号稀有密码Arg相差两个碱基 (CAG→CGA) ,但二者编码产生相同。重新合成引物 ,将切除信号肽的Rs AFP2 基因和Rs AFPm基因分别克隆到pET 2 1b(+ )质粒载体上 ,导入大肠杆菌BL2 1菌株。Tricine SDS PAGE电泳显示工程菌中存在 6KD左右的目的蛋白带 ;软件分析显示 ,突变后pETAFPm的表达产物约为突变前 pETAFPo表达产物的2倍 ;抑菌结果表明 ,pETAFPm表达产物的抑菌半径大于 pETAFP2 表达产物的抑菌半径。这些都说明改造后的Rs AFPm基因与Rs AFP2 基因相比 ,已有效的提高表达量。

PCR技术对人IL-3 cDNA进行定点突变的研究

本文利用PCR技术对人IL-3cDNA体外进行定点突变,将人IL-3cDNA第3位Met,第116位Lys密码子突变为Val密码子GTT。PCR扩增片段核苷酸序列与引物设计相应的cDNA突变体序列完全一致。结果证实此方法比经典寡聚核苷酸方法简单、迅速、成本低、效率高,也为基因的修饰,蛋白质工程研究提供了简便、稳定的方法。

突变体富集PCR法检测非小细胞肺癌病理组织EGFR基因突变

目的建立突变体富集PCR法榆测非小细胞肺癌病理组织中的EGFR基因突变。方法选取55例细支气管肺泡癌和59例非小细胞肺癌病理组织蜡块，提取基因组DNA，采用不同的突变体富集PCR法（PCR—PAGE和PCR—RLFP）检测EGFR基因常见的19和21外显子突变，并经过直接测序验证。结果在59例非小细胞肺癌中共检测出EGFR基因突变22例，突变率为37．3％（22／59）。55例细支气管肺泡癌中共检测出24例基因突变，突变率为43．6％（24／55）。经直接测序验证，EGFR19外显予有3种类型缺失突变。EGFR21外显子的错义突变为L858R。结论突变体富集PCR法准确、快速、经济，便于临床筛查非小细胞肺癌病理组织中的EGFR基因突变。

四引物扩增受阻突变体系PCR在苦瓜抗白粉病分子标记开发中的应用

以苦瓜高抗、高感白粉病的父母本及其F2代为试材,根据双本测序比对获得的SNP突变位点来设计四引物ARMS PCR分子标记引物。采用正交设计L16(44)方法对模板DNA、dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶4个因素和内外引物的浓度比进行体系优化,并利用优化后的体系对引物进行筛选。研究了适用于苦瓜的四引物ARMS PCR分子标记开发及引物筛选体系,以期为苦瓜抗白粉病分子标记辅助选择提供参考依据。结果表明:对优化后的四引物ARMS PCR体系验证,能正确地在父母本及其F2代中分型,优化后的体系适用于苦瓜抗白粉病的四引物ARMS PCR分子标记的筛选。

定点突变和随机突变PCR构建噬菌体突变次级抗体库方法的比较

目的以突变Tomlinson I库中筛选的抗细胞黏附分子L1的胞外区单链抗体为例,对定点突变和随机突变两种构建噬菌体抗体次级库的方法进行比较。方法设计定点突变和随机PCR引物在基因水平经PCR、酶切、连接将已有噬菌粒引入突变后转染大肠杆菌构建噬菌体次级抗体库;之后使用噬菌体ELISA确定阳性单克隆比例,采用皮尔森χ2检验进行比较。结果两种方法构建的次级抗体库库容分别为1.4×106pfu/mL和2.5×106pfu/mL,两库阳性单克隆比例分别为32.5%和35.5%,二者相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论两种突变方法都有望获得高亲和力的抗体。