荧光定量聚合酶链式反应联合显色培养法在孕晚期孕妇B群链球菌筛查中的价值

目的 分析荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)联合显色培养法在孕晚期孕妇B群链球菌筛查中的价值,为临床提供参考。方法 选取2022年10月至2024年3月阳光融和医院孕35~37周行B群链球菌筛查的1 000例孕妇进行回顾性分析,分别采用B群链球菌显色培养法、qRT-PCR法对孕妇肛拭子或阴拭子B群链球菌进行检测。以肉汤增菌培养法为金标准,比较B群链球菌显色培养法、qRT-PCR法检测B群链球菌的一致性;评估B群链球菌显色培养法、qRT-PCR法对B群链球菌的检测效能;以B群链球菌显色培养法、qRT-PCR法任一检测方法阳性作为联合检测阳性,评估联合检测与肉汤增菌培养法对B群链球菌的检测一致性及检测效能。结果 1 000例标本经金标准检出阳性94例,阴性906例,阳性检出率为9.40%。B群链球菌显色培养法检出阳性89例,阴性911例,阳性检出率为8.90%,与金标准检测一致性中等(Kappa值=0.681,P<0.05);qRT-PCR法检出阳性98例,阴性902例,阳性检出率为9.80%,与金标准一致性较好(Kappa值=0.839,P<0.05);联合检测阳性148例,阴性为852例,阳性检出率为14.80%,与金标准检测一致性较好(Kappa值=0.881,P<0.05)。与B群链球菌显色培养法相比,qRT-PCR法检测灵敏度、准确率均较高,漏诊率较低,联合检测灵敏度较高,特异度、漏诊率均较低(均P<0.05);与qRT-PCR法相比,联合检测灵敏度较高,特异度、漏诊率均较低(均P<0.05),准确率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 B群链球菌显色培养法、qRT-PCR法联合检测可提高检测敏感度,提升B群链球菌阳性检出能力,可为临床诊断提供参考。

多重聚合酶链式反应-毛细管电泳技术检测5种食源性致病菌

目的利用多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)-毛细管电泳技术,构建一种快速检测沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的方法。方法针对5种食源性致病菌,选择保守性较好的致病基因设计特异性多重PCR引物,利用毛细管电泳成像分析多重PCR产物。通过对PCR及电泳条件进行优化,建立5种食源性致病菌的多重PCR-毛细管电泳检测方法,并对其特异性、灵敏度进行研究。结果5对引物特异性良好,均未出现非特异性扩增,多重PCR最佳引物浓度为0.2μmol/L,最佳退火温度为56.0℃,毛细管电泳最佳分离模式为AM900,灵敏度较高,检测灵敏度可达到5×10^(-3) ng/μL。结论本研究建立的多重PCR-毛细管电泳方法用于检测5种食源性致病菌,操作简便、特异性和灵敏度高,在食源性致病菌检验中具有较好的实用价值。

实时荧光聚合酶链式反应法快速鉴定阪崎克罗诺杆菌

目的根据DNA旋转酶B亚基(gyrB)基因设计特异性的引物探针,建立一种能够快速准确鉴定阪崎克罗诺杆菌的实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法寻找并在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)中下载目标基因序列,使用DNAMAN进行序列比对,Primer Express软件设计引物探针。通过特异性实验、绝对灵敏度、相对灵敏性实验、抗干扰实验对所建立方法进行方法验证。选择本实验室保存的36种40株食品中常见致病菌的标准菌株进行特异性验证。结果多维度特异性验证实验结果显示该方法能够特异性地检测出阪崎克罗诺杆菌,对亲缘关系较近的其他克罗诺杆菌及食品中较为常见的致病菌均无非特异性扩增。DNA检测灵敏度可以达到0.0100 ng/μL,相对灵敏度可以达到10^(3) CFU/mL。抗干扰实验结果显示,将干扰菌和干扰菌DNA分别与阪崎克罗诺杆菌和阪崎克罗诺杆菌DNA进行混合检测,对检测结果无显著影响,说明该方法抗干扰能力良好。结论本研究所设计的引物探针在实时荧光PCR方法下对食品样品中阪崎克罗诺杆菌的检测具有特异、快速、敏感和抗干扰的特点,可为以后食品中阪崎克罗诺杆菌的检测提供技术支撑。

荧光聚合酶链式反应探针熔解曲线技术检测痰标本中结核分枝杆菌异烟肼耐药性的价值分析

目的:分析荧光聚合酶链式反应探针熔解曲线(MeltPro)技术在检测痰标本中结核分枝杆菌异烟肼耐药性的应用价值。方法:选取2022年6月—2024年6月句容市疾病预防控制中心收治的肺结核患者347例作为研究对象,采集患者痰标本,进行菌种分离培养,采用液体药敏试验、MeltPro技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性,以液体药敏试验结果为“金标准”,分析MeltPro技术检测异烟肼耐药性的效能。结果:MeltPro技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的敏感度为87.50%,特异度为95.87%,准确度为95.68%。MeltPro技术检测与液体药敏试验检测结果的一致性尚可(Kappa=0.728)。结论:MeltPro技术检测痰标本中结核分枝杆菌异烟肼耐药性的效能较高,有利于临床医生快速且准确地筛查患者耐药情况。

猪萨佩罗病毒聚合酶链式反应检测方法的建立及应用

猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus,PSV)是引发猪腹泻的重要病毒之一。为开发一种能快速、准确检测PSV的聚合酶链式反应检测方法,针对PSV的保守区3D基因设计了一对特异性引物,优化了聚合酶链式反应退火温度,分析聚合酶链式反应检测方法特异性和灵敏度,并应用于猪场样品检测。结果表明:建立的聚合酶链式反应检测方法可特异性扩增出PSV目的片段,对其他非靶标猪腹泻病毒则无条带产生,检测低限为5拷贝/μL;在浙江地区采集的88个健康猪粪便样本中检测PSV阳性率为7.95%。该PSV聚合酶链式反应检测方法特异性强、灵敏度高,可应用于PSV前期诊断和防控。

基于引物快速固化技术的实时荧光聚合酶链式反应检测方法

目的开发一种快速、低成本的引物干燥与固定新技术,以实现载脂蛋白E基因亚型的实时荧光聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法研究不同粘附着色剂性能、实现引物快速干燥固化,建立一种固化引物模式的实时荧光PCR方法对6种载脂蛋白E基因亚型进行检测,并对新方法的常温储存性能、检测特异性、灵敏度和准确度及与基因测序法的结果一致性实施试验评价。结果固化引物技术仅需高温干燥,固化后的引物可常温储运,稳定性高,不影响PCR扩增。建立的固化引物模式的实时荧光PCR方法检测载脂蛋白E基因准确性高、特异度好,灵敏度为0.63 ng/μL,与传统的液体PCR试剂灵敏度一致。临床样本验证结果表明,本方法与基因测序的符合率为100%。结论本文建立的固化引物实时荧光PCR法可提高多突变位点基因检测操作的便捷性与检测通量选择的灵活性。

聚合酶链式反应检查法、细菌培养法在阴道细菌检查中的应用价值

目的:探究聚合酶链式反应(PCR)检查法、细菌检查法在阴道细菌检查中的应用价值。方法:选择2022年1—12月进行阴道细菌检查的阴道炎患者作为研究对象,共45例。收集所有患者的阴道分泌物,行PCR检查和细菌培养法检查,分析检验结果。结果:PCR检查法阳性检出率高于细菌培养法、肠球菌、棒状杆菌、加特纳菌、检出率高于细菌培养法(P<0.05)。结论:在阴道细菌检查中,PCR检查法相对于细菌培养法具有更高的应用价值,其病原菌检出率更高,为细菌性阴道炎的准确诊断和个体化治疗提供了更可靠的手段。

TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌

目的建立TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法。方法通过比对沙门氏菌和志贺氏菌的基因组序列,选择同源性高、保守性好的区域设计特异性引物和探针,经过引探筛选、浓度调试等一系列优化,建立了食源性沙门氏菌和志贺氏菌双重荧光PCR核酸检测方法,并对其特异性、质粒最低检出限、菌液敏感性、重复性、稳定性以及实际样品进行了验证。结果该方法与大部分食源性致病菌无交叉反应,特异性强;沙门氏菌和志贺氏菌质粒的最低检出限可达5 copies/μL,沙门氏菌菌液敏感性为1.0×10^(2) cfu/mL,志贺氏菌菌液敏感性10 cfu/mL;质粒和菌液核酸梯度的批内和批间变异系数均在0.177%~1.958%之间,小于5.0%,具有较强的稳定性;标准曲线相关系数(r^(2))均大于0.999。结论本研究成功建立了一种TaqMan探针双重荧光PCR技术同时检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法,该方法扩增时间短,只需要30 min即可,而且特异性强、稳定性好,可用于疑似沙门氏菌和志贺氏菌污染样品的检测,为食品安全的快速检测提供技术支撑。

基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应法的A1/A2牛奶鉴别试剂盒的开发及应用

目的基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应(amplification refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR)技术,开发A1A2牛奶鉴别试剂盒,并对市场上A2牛奶产品进行检测应用,实现对A2牛奶的鉴别检测。方法本研究先利用D-loop基因片段设计了牛内参基因引物探针组(标记FAM荧光)。随后,在β-酪蛋白基因突变位点分别设计了A1基因引物探针组和A2基因引物探针组(均标记VIC荧光)。基于ARMS-PCR技术构建了双通道ARMS-PCR反应体系与程序,进而成功开发了A1A2牛奶实时荧光ARMS-PCR试剂盒。为进一步验证试剂盒性能,将其应用于市场上A2牛奶的检测,并将检测结果与DNA测序法结果对比。结果本试剂盒特异性强,检测DNA灵敏度为0.1 ng/L;10份市售实际样品的应用检测结果与测序结果一致。结论本试剂盒特异性好,灵敏度高、准度度高,适用于A2牛奶的真实性鉴别。

SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量

目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测5种养殖石斑鱼的神经坏死病毒

神经坏死病毒(Nervousnecrosisvirus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原。发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染。2003年4～8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从福建南部人工养殖的5种石斑鱼即紫石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)、马拉巴石斑鱼(E.malabaricus)、青石斑鱼(E.awoara)、赤点石斑鱼(E.akaara)和云纹石斑鱼(E.moara)中检出5个神经坏死病毒分离株。检测了76份石斑鱼样品,这些石斑鱼NNV病毒的平均感染率约为90%。对这些病毒的RT-PCR产物421bp核酸进行了测序和序列分析,其相同的序列超过99%。将这些序列与GenBank的石斑鱼(Epinephelusspp.)神经坏死病毒相关基因序列作比较,同源性在97%以上。对神经坏死病毒在石斑鱼体内的分布也进行了分析,在脑和眼组织的检出率最高,部分病鱼的肝、脾和肾组织也能检出病毒。结合流行病学特征,可确认神经坏死病毒为该传染病的主要致病原。RT-PCR方法是检测NNV等病原的一种理想的诊断方法。

鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立

【目的】建立一种能区分猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法。【方法】根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列,选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物,建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。【结果】应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段,但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0.04pg的CSFVRNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测,结果表明,有14份类似猪瘟强毒,1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。【结论】本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒,减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。

PCR(聚合酶链式反应)仪温度特性的实验研究与分析

该文的目的是测量PCR温度的精确性和PCR仪上孔间以及不同循环和不同次测量的温度均一性。PCR程序:95℃(变性),30 s;55℃(退火),40 s;72℃(延伸),50 s;6个循环。孔和管内的温度重复性都很好;变性阶段,孔和管内液体温度与程序温度偏差较大,孔及管内的温度均一性和重复性均很好;孔内温度不能达到通常所需的温度(90℃以上)的比例为22.2%。退火和延伸阶段孔和管内的温差较小;有2个孔不能达到通常需要的温度。实际温度在各阶段停留的时间分别占设定时间的90%的比例较低。这些缺陷可能导致扩增结果假阳性或假阴性。

检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的建立及初步应用

根据GenBank上登录的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)基因组全序列,选择CDV强、弱毒株间有区别保守区设计了一对通用引物P1和P4,并在该对引物跨越区域的内部设计了CDV强毒株特异性引物P2及弱毒株特异性引物P3,用引物P1/P4进行RT-PCR,然后用引物P2/P3/P4进行复合套式PCR,建立了一种能区分CDV强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的鉴别诊断方法。应用该方法从CDV强、弱毒株的基因组中分别扩增出了大小为247bp和177bp的特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为247bp和177bp的两条特异性片段,与犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒的细胞培养物以及正常细胞对照组进行复合RT-nPCR扩增时均为阴性。对从黑龙江省和吉林省采集的20份疑似CDV病料进行的检测结果表明,有15份类似CDV强毒,5份类似CDV弱毒。本研究建立的复合RT-nPCR可以有效检测CDV感染,能够将强、弱毒株区分开,可用于临床快速检测、流行病学监测以及追踪疫苗免疫效果等。

应用聚合酶链式反应(PCR)技术检测野猪的氟烷基因

猪应激综合征(ProcineStressSyndrome,PSS)是指猪在应激因子的作用下发生恶性高热综合症(MalignantHyper thermiaSyndrome, MHS)。试验随机选取18头纯种野猪提取基因组DNA进行聚合酶链式反应,扩增得到RYR1 基因特异片段,经过HhaⅠ酶切阳性鉴定可断定这18头猪的RYR1 基因都没有发生突变,因此不存在猪应激综合征问题。

实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测4种食源性致病弧菌

目的建立和优化4种食源性致病弧菌的实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)快速检测方法。方法基于副溶血性弧菌的toxR基因(GenBank ID:MH047287.1)、霍乱弧菌的ompW基因(GenBank ID:MF100046.1)、拟态弧菌的toxR基因(GenBank ID:EF693743)和创伤弧菌的vvhA基因(GenBank ID:KC821520.1)设计常规PCR引物和qPCR特异性引物和探针。分别建立副溶血性弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌4种食源性致病弧菌的单重qPCR检测体系,根据扩增曲线和Ct值对探针浓度进行优化,设置探针浓度梯度。结果4种弧菌的探针最适浓度均为0.1µmol/L。对设计的4种弧菌的引物分别进行常规PCR的扩增,其最低检出限均为1×10^(5) copies/µL,4种弧菌分别进行单重qPCR的最低检出限均为1×10^(1) copies/µL,扩增效率均接近100%。qPCR的灵敏度均高于常规PCR。特异性实验结果表明,4种目的弧菌DNA扩增出特异性曲线,其他的非目的基因未被扩增出扩增曲线。结论该方法准确度和灵敏度高,前处理简单快速,适用于4种食源性致病弧菌的荧光定量PCR快速检测。

香辛料SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应检测方法的建立及应用

目的:本研究致力于建立香辛料真实性成分的分子鉴定方法,为香辛料的掺假提供有效的鉴定和检测方法,在不同的使用条件下分别实现定性或半定量分析,为建立相关标准提供一定的基础技术支撑。方法:研究采用SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,通过设计特异性引物成功建立了特异性检测八角、茴香、胡椒和花椒的分析技术。结果:该方法能够特异性检测出八角、茴香、胡椒、花椒,Ct值在标准品体积分数0.001%~10%范围内线性关系良好。针对八角标准品,检测限为1%;针对茴香、花椒、胡椒标准品,最检测限均为0.001%。利用该方法对5份实际样本进行检测,分别在样本1中未检测出八角、茴香、胡椒、花椒;样本2、3、5中检测出八角、茴香、胡椒;样本4中检测出八角、茴香、胡椒、花椒。结论:本实验建立的SYBR GREENⅠ染料实时PCR方法灵敏度高、重复性好,可应用于实际样品的检测。

数字聚合酶链式反应技术在食品安全核酸检测领域中的研究进展及标准化现状

数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)是一种新型核酸扩增技术,无需借助内参基因和标准曲线,通过极限稀释和泊松分布统计即可实现核酸单分子层面的绝对定量分析,具有高灵敏度、高精确度和高耐受性等技术优势,在食品安全核酸检测领域具有极大的发展潜力。本文介绍了dPCR的技术原理、优缺点及商业化平台,综述了dPCR在食源性致病菌检测、动物和植物源性成分检测、转基因成分检测和食源性病毒检测等领域的研究进展及标准化现状,并分析了该技术存在的技术难题和未来发展方向,以期为dPCR在食品安全核酸检测领域中的应用推广和标准制定提供研究思路。

聚合酶链式反应(PCR)量热学的实验研究

聚合酶链式反应(PCR)是一种人工体外扩增特异DNA片段的技术。PCR反应的三个过程都是热过程。本文首次利用差式扫描量热仪(DSC)模拟PCR反应。试验表明PCR反应变性过程是吸热过程;退火和延伸过程是放热过程;并且获得了这些过程的量热学数据。这些研究结果对分析和判断PCR临床检验的假阴性是有用的。

聚合酶链式反应(PCR)用于检测环境水体指示菌的研究

对聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ） 快速检测水体指示菌———大肠菌群（ｔｏｔａｌ ｃｏｌｉｆｏｒｍ） 和大肠杆菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） 进行了研究．采用的两对引物分别扩增了ＬａｃＺ基因的约２６０ｂｐ 和ＵｄｉＡ 基因的约１５０ｂｐ ＤＮＡ 片段．引物Ⅰ和引物Ⅱ最低能分别扩增１０ － ６μｇ 或１０ －８ μｇ 基因组ＤＮＡ．整个检测工作在采集水样后５ —６ｈ 内完成．与常规水质检测法相比，ＰＣＲ 法具有快速，准确的特点。