酸敏感钾通道-3真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的表达

目的:构建酸敏感钾通道-3(TASK3)的真核表达载体,通过转染SH-SY5Y细胞建立稳定表达的细胞株。方法:将TASK3亚克隆至p EGFP-N1质粒上,构建重组质粒p EGFP-TASK3,利用X-fect试剂盒将其转染至SHSY5Y细胞中,通过G418辅助荧光筛选建立稳定表达TASK3-e GFP的细胞株;Western blot和激光共聚焦检测TASK3-e GFP的表达及细胞内定位;不同p H值(7.0、6.7、6.4、6.1)作用稳定表达细胞株24 h后,CCK-8检查细胞活力。结果:重组真核表达载体构建正确,获得了TASK3-e GFP稳定表达细胞株。不同p H值作用野生型和稳定表达细胞株24 h后,两组细胞的存活率随着p H值降低而显著降低(P<0.05)。相同p H值下(除p H 7.0),稳定表达细胞存活率较野生型细胞显著升高(P<0.05)。结论:成功构建p EGFP-TASK3真核表达载体,建立了稳定表达TASK3-e GFP的SH-SY5Y细胞株,该细胞可为研究TASK3的功能奠定基础。

α-synuclein在体外培养SH-SY5Y细胞中过表达致自体吞噬

目的:观察α-synuclein转基因细胞内α-synuclein过表达对细胞超微结构的影响。方法:Lipofectamine法转染SHSY5Y细胞,用G418对转基因细胞进行筛选,免疫荧光细胞化学检测α-synuclein表达,电子显微镜观察转基因细胞超微结构的改变。结果:转基因细胞内出现大小不等、边界明显的自体吞噬体并伴有线粒体结构紊乱。结论:α-synuclein过表达可致细胞出现自体吞噬现象。

维甲酸诱导分化对SH-SY5Y细胞阿片受体表达的影响

目的研究维甲酸诱导SH-SY5Y细胞分化后对阿片受体表达的影响。方法 1×10-5mol.L-1维甲酸诱导SH-SY5Y细胞分化6天,[3H-diprenorphine]放射性配体受体结合试验确定阿片受体表达量。结果维甲酸诱导分化6天后,与对照细胞比较,SH-SY5Y细胞突起增多增长类似轴突,且细胞间形成明显神经纤维网络,细胞生长明显减慢,阿片受体表达提高1.6倍以上。结论维甲酸明显诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化,且分化后细胞阿片受体表达明显上调。

用慢病毒转染技术实现Gnaq基因在SH-SY5Y细胞中持续稳定高表达

目的探讨用慢病毒转染技术实现Gnaq基因在人神经母细胞瘤株SH-SY5Y中持续稳定高表达的可行性,为深入研究Gnaq在脑衰老及相关疾病中的作用及分子机制奠定基础.方法通过NCBI网站查询Gnaq的编码序列并设计相应的克隆引物,以高表达Gnaq的HepG2细胞的cDNA为模板,PCR扩增得到带适宜酶切位点的目的基因,将目的基因连接入慢病毒载体PLIG,转染感受态细胞,筛选阳性克隆,测序鉴定后包装慢病毒,转染SH-SY5Y细胞;于转染后24 h、第5代时检测GFP荧光表达率;检测第3代、第5代PLIG-Gnaq-SH-SY5Y细胞内Gnaq的转录水平.结果荧光检测显示SH-SY5Y细胞的转染效率接近100%,此表达效率可持续至转染后第5代;RT-PCR检测显示转染后第3代、第5代的PLIG-Gnaq-SH-SY5Y细胞内Gnaq呈明显的高转录水平,未明显受冻存的影响.结论利用慢病毒转染技术实现Gnaq基因在SH-SY5Y细胞内长期稳定高表达具有可行性,可用PLIG-Gnaq-SH-SY5Y作为模型细胞深入研究Gnaq基因在神经细胞中扮演的角色及相关机制.

p53基因在RA诱导SH-SY5Y细胞分化后低表达

全反式维甲酸(RA)的抑制肿瘤细胞生长和调控细胞分化的作用是一项重要的研究课题。而p53基因是一个重要的肿瘤抑制基因,在RA的作用中是否涉及到p53的作用尚有待阐明。本文用低浓度的RA(10 μmol/L)作用于SH-SY5Y细胞,每2d换一次液,在作用9 d后,用光学显微镜观察SH-SY5Y细胞的形态学变化,并提取细胞质总RNA进行RT-PCR反应半定量检测p53基因表达。结果显示,SH-SY5Y细胞经RA诱导后,细胞生出较长的突起,具有神经元的形态;而对照组保持成纤维细胞的形态、无明显的形态学变化。RT-PCR半定量显示,在细胞诱导后,p53基因表达明显下调。本文结果提示,RA的作用可能独立于p53基因途径,p53基因的表达变化可能是继发于RA的作用。

稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系的建立

目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)/增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y,建立稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系MCHR2-SH-SY5Y。方法:采用聚合酶链反应(PCR)法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段。用基因重组方法将其克隆到质粒pEGFPN1,构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,并用LipofectamineTM转染到SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞系,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting检测MCHR2的表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位。结果:扩增出人MCHR2全长cDNA;成功构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2;RT-PCR、Western blotting检测到MCHR2-SH-SY5Y细胞MCHR2的表达,激光共聚焦显微镜观察转染pEGFPN1-MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞融合蛋白定位于细胞膜,而转染空质粒pEGFPN1的SH-SY5Y细胞EGFP定位于细胞质。结论:成功建立稳定表达人MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞株。

稳定表达GFP-Parkin融合蛋白的SH-SY5Y细胞系的建立和功能初探

目的:建立稳定表达GFP-Parkin的SH-SY5Y细胞系,并检测Parkin对MPP^+引起的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。方法:将Parkin编码序列克隆到载体pEGFP-C1中,构建重组质粒pEGFP-Parkin,转染SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,建立稳定表达GFP-Parkin的SH-SY5Y细胞系;荧光显微镜和Western印迹鉴定Parkin表达,MTT法检测Parkin对MPP^+致细胞损伤的保护作用。结果:酶切鉴定及测序结果表明重组质粒pEGFP-Parkin构建正确;荧光显微镜下可见细胞内有GFP-Parkin的融合表达,Western印迹检测发现相对分子质量79×103的蛋白条带;MTT结果显示Parkin能够减弱MPP^+对SH-SY5Y细胞的损伤,与对照组相比,存活率高约15%,差异显著(P<0.05)。结论:构建了稳定表达GFP-Parkin的SH-SY5Y细胞系,为进一步研究Parkin的细胞保护作用和其他功能机制奠定了基础。

α7尼古丁受体mRNA表达抑制对SH-SY5Y细胞氧化应激水平的影响

目的：探讨通过RNA干扰技术抑制神经母细胞瘤细胞（SH-SYSY细胞）中α7尼古丁乙酰胆碱受体（nAChR）基因表达后细胞氧化应激水平的变化，以了解该受体的神经保护作用。方法SH-SY5Y细胞转染针对α7MChR的小分子干扰RNA，Real-timePCR法检测转染细胞中α7nAChRmRNA水平蛋白质印迹方法检测蛋白表达水平；并用Aβ1-2处理培养细胞，比色法测定细胞脂质过氧化产物水平、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性。结果转染siRNA后，α7nAChRmRNA水平和蛋白表达水平分别降低了81．7％和76．9％；细胞脂质过氧化水平升高38．4％；SOD和GSH-PK活性分别降低30．3％和21．1％。用Aβ1-2处婵细胞后氧化应激水平升高，且转染siRNA后能增强Aβ的神经毒性作用。结论α7nAChR基因表达抑制后能增强细胞氧化应激水平，同时增强Aβ的神经毒性作用。

稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-突触核蛋白单克隆SH-SY5Y细胞株的建立

目的利用分子克隆技术构建含人野生型(WT)及致病突变A30P(G88C)、A53T(G157A)α-突触核蛋白基因(α-synuclein gene,SNCA)的重组真核表达载体pLentiVENUS-YFP-SNCA,通过慢病毒转染的方法获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synuclein单克隆SH-SY5Y细胞株。方法提取红白血病细胞K562细胞总RNA,以RT-PCR法扩增SNCA,SNCA与克隆载体PMD-19T的体外连接(T-A克隆)后进行基因测序,将测序正确者以限制性内切酶酶切后与真核表达载体pLentiVENUS连接,建立野生型重组真核表达载体。取正常SNCA与克隆载体连接体,利用单核苷酸差异引物定点突变法构建SNCA的两个突变型A30P、A53T,经基因测序、酶切与真核表达载体pLentiVENUS连接,建立突变型的重组真核表达载体。以磷酸钙沉淀法转染293T细胞制备的慢病毒转染SH-SY5Y细胞,利用流式细胞仪BD AriaⅢ进行96孔板单细胞分选以获得稳定过表达人野生型及致病突变型A30P、A53Tα-突触核蛋白的单克隆细胞株,并通过倒置荧光显微镜、蛋白免疫印迹、逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriotion-polymerase chain reaction,Rt-PCR)、鉴定各单克隆SHSY5Y细胞株是否过表达。结果 Rt-PCR及电泳结果显示所获得目的基因,基因测序结果正确;重组真核表达载体pLentiVENUS-SNCA经限制性内切酶酶切和基因测序证明构建成功。倒置荧光显微镜显示除对照组(未转染组)外,空载体转染组及载体与SNCA重组后转染组均有荧光蛋白表达;但蛋白免疫印迹结果显示载体与正常或突变的SNCA重组后转染组的蛋白含量高于空载体组。RT-PCR结果显示载体与正常或突变的SNCA重组后转染组的细胞RNA表达量高于空载体组。结论利用分子克隆技术和慢病毒转染技术成功建立过表达α-突触核蛋白的WT及A53T、A30P突变型SH-SY5Y单克隆细胞株。

SH-SY5Y神经细胞中α3尼古丁受体基因表达沉默对β分泌酶蛋白表达的影响

目的:研究α3神经型尼古丁受体(nAChR)基因沉默对β分泌酶(BACE)蛋白表达的影响。方法:稳定转染α3 nAChR siRNA表达质粒及空质粒的SH-SY5Y神经细胞与正常对照组细胞,用Real time-PCR和Western印迹法检测α3 nAChR mRNA表达和蛋白水平表达,评价RNA的干扰效率;用蛋白质印迹方法分别检测细胞中β分泌酶2个亚型(BACE1和BACE2)蛋白表达水平的变化。结果:稳定转染α3 nAChR siRNA表达质粒的细胞克隆株,与空质粒和正常对照组相比BACE1蛋白表达水平增加,BACE2蛋白表达水平减少。结论:α3 nAChR可以通过增加BACE2蛋白表达水平及减少BACE1蛋白表达水平,影响Aβ生成从而减少Aβ的神经毒性作用,发挥神经保护作用。

基于PCR的siRNA表达框的制备

目的改进目前基于PCR的方法制备siRNA表达框,转染细胞后产生高效的RNA干扰作用。方法从K562细胞中提取基因组DNA,以此为模板,PCR扩增U6启动子序列并克隆至pMD18-T载体中,用载体上的引物进行扩增,所得产物即制成作为扩增siRNA表达框的模板。选择p53为靶基因,扩增制备siRNA表达框,测序验证后,转染SH-SY5Y 细胞48h后提取RNA进行RT-PCR,检测RNA干扰的效应。结果测序结果表明所克隆的U6启动子序列正确。细胞转染表达框,在mRNA水平上,p53基因的表达明显受到了抑制。结论本实验所制作的基于PCR的方法制备siRNA表达框可以很好地应用于RNAi作用研究。

γ-氨基丁酸Rho2受体在神经母细胞瘤细胞中的稳定表达及其在谷氨酸盐致细胞死亡中的作用

目的构建人γ-氨基丁酸(GABA) Rho2受体(GABRR2)真核表达载体,并转染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,建立稳定表达细胞株,探讨GABRR2在谷氨酸盐致细胞死亡中的作用。方法采用快速克隆方法将人脑组织GABRR2基因克隆至p IRES2-eGFP质粒,构建重组质粒p IRES2-eGFP-Rho2,利用X-fect试剂盒将其转染至SH-SY5Y细胞中,使用遗传霉素进行筛选,建立稳定表达p IRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y细胞株。使用流式细胞术检测稳定转染过表达p IRES2-eGFP-Rho2的细胞,利用免疫荧光法鉴定稳定转染的SH-SY5Y细胞中p IRES2-eGFP-Rho2的表达。将野生型SH-SY5Y细胞分为A1、B1、C1组,稳定表达p IRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y细胞分为A2、B2、C2组,每组设3个平行孔,其中A1、A2组细胞使用达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)孵育,B1、B2组细胞使用含有谷氨酸盐的DMEM孵育,C1、C2组细胞使用含有谷氨酸盐和GABA的DMEM孵育,将各组细胞置于细胞培养箱中培养24 h,应用乳酸脱氢酶试剂盒检测各组细胞的存活率。结果重组真核表达载体构建正确,获得了稳定表达p IRES2-eGFP-Rho2的细胞株。A1、B1、C1组细胞存活率比较差异有统计学意义(F=5. 542,P <0. 05);其中B1、C1组细胞存活率显著低于A1组(P <0. 05),C1组细胞存活率显著高于B1组(P <0. 05)。A2、B2、C2组细胞存活率比较差异有统计学意义(F=6. 588,P <0. 05);其中B2、C2组细胞存活率显著低于A2组(P <0. 05),C2组细胞存活率显著高于B2组(P <0. 01)。A2组细胞存活率与A1组比较差异无统计学意义(P> 0. 05),B2组细胞存活率显著低于B1组(P <0. 05),C2组细胞存活率显著低于C1组(P <0. 05)。结论成功构建p IRES2-eGFP-Rho2真核表达载体,建立了稳定表达p IRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y细胞株,为体外研究GABRR2的功能提供了实验基础,并证明使用GABA可缓解谷氨酸盐对细胞的损伤,为缺血性脑损伤的分子生物学治疗提供了靶点。

TAZ诱导性过表达慢病毒载体的构建、鉴定及诱导过表达TAZ神经母细胞瘤细胞株的建立

神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见且致死性极高的实体肿瘤之一[1]。由NB所致死亡人数占所有儿童肿瘤死亡总数的15%[2]。分子靶向治疗是近年肿瘤领域研究的热点[3]。TAZ是一个包含WW-domain结构域的转录共激活子,参与多种肿瘤细胞的增殖、调控肿瘤转移,并能预测部分肿瘤患者的预后情况[4]。针对Oncomine肿瘤数据库NB肿瘤组织的生物信息学分析发现,TAZ基因在NB肿瘤组织中呈高表达,且随着NB的恶化,表达逐渐升高。而TAZ是否参与NB的形成及恶化尚未完全明确。

Bcl-xl基因克隆及其在SH-SY5Y细胞中的表达

目的研究Bcl-xl基因在SH-SY5Y细胞中的表达。方法构建真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,采用脂质体介导将重组质粒导入SH-SY5Y细胞,RT-PCR和Western-blot检测外源基因表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,并用脂质体介导的方法高效转染SH-SY5Y细胞,RT-PCR显示有Bcl-xlmRNA表达增加,Western-blot显示有32kD的蛋白质表达增加。结论重组质粒pIRES2-EGFP/Bcl-xl经转染能够在SH-SY5Y细胞中高效表达,为进一步研究Bcl-xl对SH-SY5Y细胞的生物学功能奠定了基础。

HSP70沉默表达对缺氧状态下SH-SY5Y细胞凋亡的影响及机制研究

缺氧性脑病是人类死亡的重要原因，且发病呈逐年增高的趋势。虽然对缺氧性脑病的研究已涉及多方面，但因其发病机理复杂、部位特殊，仍无理想治疗药物。因此，寻求防治缺氧性脑病的方法已成为刻不容缓的任务。有研究表明，外源性HSP70表达可有效减轻神经元缺氧再复氧损伤的程度，但其作用机制尚不明确。本实验采用RNA干扰技术沉默HSP70，观察其对缺氧状态下神经细胞凋亡及BAG-1、Caspase-3、NF—κB表达的影响，进一步探讨HSP70在缺氧性脑病中的保护作用及机制。

MPST基因慢病毒载体的构建及在SH-SY5Y细胞中的表达

为构建MPST基因慢病毒表达载体,获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株,本研究通过PCR扩增出MPST目的基因,将其克隆到慢病毒表达载体p EB-GFP (T2A) PURO上,将重组慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒系统(pLP/VSVG, pLP1, p LP2)共转染293T细胞,用获得重组的慢病毒液感染SH-SY5Y细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达MPST基因的(SH-MPST)细胞株。采用Real-time PCR和Western blotting以及ELISA等方法对筛出来的SH-MPST中的MPST的表达及功能进行鉴定。与空转染组(SH-PEB)相比,SH-MPST细胞中MPST mRNA及蛋白的表达水平显著增加,且细胞内MPST酶活性、酶含量及细胞释放硫化氢的水平均显著增加(p<0.05)。以上研究表明,MPST基因慢病毒表达载体成功构建,并获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株,这将为MPST功能的深入研究提供依据。

重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建及真核细胞转染

目的 构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因的真核细胞表达载体,为应用GDNF进行如帕金森综合征之类的神经元退化性疾病的基因治疗打基础。方法 采用RT- PCR方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出该基因的c DNA序列,并克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体p EGFP- C1中,对重组质粒p EGFP- GDNF进一步鉴定。采用电转及阳离子脂质体将重组质粒p EGFP- GDNF转染至SH- SY5 Y细胞。结果 大鼠GDNF c DNA已正确地克隆到真核表达载体p EGFP- C1中,而构建成重组大鼠质粒p EGFP-GDNF。GDNF基因可稳定表达在细胞中。结论 真核细胞表达载体p EGFP- GDNF以及表达GDNF工程细胞SH-SY5 Y的成功构建,为进一步开展GDNF基因治疗PD等中枢神经系统疾病奠定了基础。

LncRNA MEG3对MPP^(+)诱导的帕金森病细胞模型损伤的影响及机制

目的探究长链非编码RNA(LncRNA)母细胞表达基因(MEG)3对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP)^(+)诱导的帕金森病(PD)细胞模型损伤的影响及机制。方法RT-PCR检测MPP+处理的SH-SY5Y细胞中LncRNA MEG3表达;将阴性对照siRNA和LncRNA MEG3 siRNA转染至SH-SY5Y细胞中,RT-PCR检测转染后细胞中LncRNA MEG3表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力,乳酸脱氢酶(LDH)毒性检测试剂盒检测LDH释放量,流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹检测Notch信号通路蛋白表达。结果与阴性对照组比较,不同浓度MPP^(+)处理24 h和0.5 mmol/L MPP^(+)处理不同时间均可诱导SH-SY5Y细胞中LncRNA MEG3表达显著增加(P<0.05)。与沉默对照组比较,沉默LncRNA MEG3可抑制MPP^(+)诱导的细胞活力降低、LDH释放和细胞凋亡率增加及Notch信号通路激活(P<0.05)。结论沉默LncRNA MEG3可抑制MPP^(+)诱导的PD细胞模型损伤,其机制可能与Notch信号通路激活有关。

阿尔茨海默病细胞模型中lncRNA RP11-543N12.1对CDH13表达的调控作用

目的探讨阿尔茨海默病(AD)细胞模型中长链非编码RNA(lncRNA)RP11-543N12.1对CDH13的表达调控作用。方法采用基因芯片技术筛选AD相关差异表达lncRNA和mRNA,并通过Real-time PCR技术验证AD细胞模型中lncRNA RP11-543N12.1和CDH13 mRNA表达均增加,与芯片结果一致;然后将RP11-543N12.1-siRNA转入SH-SY5Y细胞,并加入β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)作用48 h,接着MTT检测细胞存活率,Real-time PCR技术检测RP11-543N12.1和CDH13在RNA水平的变化,Western blotting检测CDH13蛋白表达,Hoechst33258染色检测细胞核的形态学变化,流式细胞术检测凋亡率。结果在未转染RP11-543N12.1-siRNA的SH-SY5Y细胞中,Aβ25-35处理48 h后,与正常细胞相比,细胞存活率降低(P<0.05),CDH13 RNA水平增加(P<0.01),CDH13蛋白活性形式表达量增加(P<0.01),细胞核出现凋亡的形态学变化,流式检测细胞凋亡率增加(P<0.01);转入RP11-543N12.1-siRNA后再用Aβ25-35处理48 h,细胞存活率、CDH13 RNA水平、蛋白活性形式表达量、细胞凋亡率均趋于正常水平,细胞核凋亡的形态学变化消失。结论 LncRNA RP11-543N12.1能够调节CDH13的表达,降低RP11-543N12.1的表达量能使CDH13表达下调。

质粒介导的RNAi对神经母细胞瘤细胞Survivin基因表达的抑制作用

目的构建Survivin的短发夹RNA表达质粒并通过由其介导的RNA干扰来下调神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞中Survivin的表达。方法针对人Survivin的mRNA序列设计合成两对寡核苷酸序列,退火后将其连入pBSHH1,对重组质粒pBSHH1-S1和pBSHH1-S2进行酶切和测序鉴定,然后将质粒转染SH-SY5Y细胞,运用RT-PCR和Western印迹检测Survivin基因的表达。结果酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被克隆到pBSHH1,pBSHH1-S1和pBSHH1-S2转染SH-SY5Y细胞后,Survivin基因的mRNA以及蛋白水平的表达量均受到明显抑制。结论成功构建了人Survivin基因的短发夹RNA表达质粒,并在SH-SY5Y细胞中验证了它们对Survivin基因的表达抑制作用,为神经母细胞瘤等肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。